萝卜硫素在小鼠糖尿病肾病中的肾脏保护机制研究

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1、前言糖尿病肾病(DN)是导致终末期肾衰竭的重要原因，至今缺乏有效的治疗手段。尽管DN的发病机制尚未明确，但是大量的实验研究证明高血糖以及由此产生的氧化应激与糖尿病肾脏损害密切相关。动物实验和临床研究显示补充外源性抗氧化剂维生素E对治疗糖尿病心血管并发症和DN效果不确定，因此，上调机体内源性抗氧化蛋白成为防治DN的新靶点。氧化应激是指体内生物氧化与抗氧化防御的不平衡，导致细胞或组织的病理性损害。核因子相关因子2(Nrf2)/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)-抗氧化反应元件(ARE)通路是近年新发现的生物机体抵抗氧化应激和化学刺激的防御性转导通路。在这个体系中，Keap1是

2、Nrf2的内源性抑制剂，Keap1能够与细胞质内的Nrf2紧密结合，将Nrf2锚定于细胞质，阻止Nrf2进入细胞核行使其转录调控功能。西兰花芽提取物萝卜硫素(SFN)能够对Keap1的半胱氨酸残基进行化学修饰，导致Keap1构象改变，并与Nrf2解耦连，Nrf2进入细胞核，与II相解毒酶和多种抗氧化蛋白（如HO-1，NQO1等）基因启动子区的ARE序列结合，促进这些基因的转录和表达。有研究证明，SFN通过上调Nrf2，减轻肾脏氧化损伤，改善DN；在Nrf2敲除鼠中，SFN失去肾脏保护作用。然而，Nrf2的哪个下游抗氧化蛋白是SFN的主要保护途径尚不清楚。另外，研究证明给予大鼠SFN干

3、预后，大鼠肝脏基因表达上调最显著的是金属硫蛋白(MT)。MT是机体最重要的非酶类抗氧化蛋白之一，无论是应用药物或是转基因工程诱导的肾脏MT高表达均能显著减轻糖尿病引起的肾脏氧化损伤，改善DN。然而，至今没有研究显示SFN是否可以通过上调肾脏MT表达改善DN，也没有研究显示MT是否为Nrf2的下游抗氧化因子。作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，SFN最初被用于癌症的治疗。有报道显示，内源性HDAC抑制剂显著上调MT，减轻氧化损伤。也有大量研究显示，多种HDAC抑制剂均能改善DN。所以，我们推测SFN有可能通过抑制HDAC活性，上调MT，减轻糖尿病导致的氧化应激，改善DN。为探讨SF

4、N是否能够改善糖尿病引起的肾脏损伤以及SFN是否通过抑制HDAC活性增加MT的表达，我们在C57BL/6J野生型小鼠中采用高脂饮食联合链I脲佐菌素腹腔注射的方法建立2型糖尿病(T2DM)的动物模型，并给予SFN干预，观察SFN对糖尿病小鼠蛋白尿、肾脏形态学改变、炎症、纤维化和氧化损伤的影响，检测肾脏MT、Nrf2、HDAC2、HDAC4的表达，并进一步用染色质免疫共沉淀的方法探讨SFN上调MT表达的表观遗传学机制。为探讨SFN对DN的保护作用是否完全由Nrf2介导，并进一步证实MT为Nrf2的下游抗氧化因子，我们分别用C57BL/6J野生型小鼠和C57BL/6JNrf2敲除小鼠诱导T

5、2DM小鼠模型，并给予SFN干预，观察SFN对野生型糖尿病小鼠和Nrf2敲除糖尿病小鼠蛋白尿、肾脏炎症、纤维化的影响，检测在缺乏Nrf2（Nrf2敲除小鼠）的情况下SFN对MT表达的影响。为探讨MT是否在SFN的肾脏保护机制中起作用，并观察MT是否影响Nrf2的表达，我们分别用129S1野生型小鼠和129S1MT敲除小鼠诱导T2DM小鼠模型，并给予SFN干预，观察SFN对野生型糖尿病小鼠和MT敲除糖尿病小鼠蛋白尿、肾脏炎症、纤维化的影响，检测在缺乏MT（MT敲除小鼠）的情况下SFN对Nrf2的表达是否有影响。我们的研究详细阐明了SFN对糖尿病肾病的保护机制，为SFN在DN中的临床应用

6、提供了实验依据及理论基础，也为其他HDAC抑制剂改善DN提供了新的线索。II中文摘要萝卜硫素在小鼠糖尿病肾病中的肾脏保护机制研究氧化应激为糖尿病肾病(DN)的重要发病机制之一，它可以促进DN的发生和发展。核因子相关因子2(Nrf2)作为转录因子，可以增加多种内源性抗氧化蛋白的转录及表达，如血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶-1(NQO1)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)等。有研究证明萝卜硫素(SFN)可以通过上调Nrf2改善DN，但是Nrf2的哪个下游抗氧化蛋白是SFN的主要保护途径尚不清楚。另外，实验证明给予大鼠SFN干预后，肝

7、脏基因表达上调最显著的是金属硫蛋白(MT)，上调了10倍以上；MT作为强效内源性抗氧化蛋白，可以显著减轻氧化应激，延缓DN的病情进展。然而，至今没有研究显示SFN是否可以通过上调肾脏MT表达改善DN，也没有研究显示MT是否为Nrf2的下游抗氧化因子。为探讨SFN是否能够增加肾脏MT的表达，我们采用高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射的方法在C57BL/6J野生型小鼠中建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型，在糖尿病模型建立的同时给予SFN干预4个月，即小鼠被分为对照