肾清饮对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其可能的机制

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　　肾清饮对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其可能的机制：郝亚宁，赵丽娟，尹爱萍，杨世锋，严俊飞【摘要】　　目的探讨肾清饮对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及可能的机制。方法40只链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠随机分成模型组、肾清饮组、贝那普利组和肾清饮联合贝那普利组，连续给药8周后观察血糖、肾功能和24h尿蛋白定量的变化，分别检测肾组织及尿中丙二醛(MDA)含量，肾组织中超氧化物岐化酶(SOD)的活性，血清转化生长因子(TGFβ1)水平的变化,光镜观察肾脏病理形态学的改变。结果各药物组肾功能明显改善，与对照组比较无显著性差异(P>0.05)，但对血糖无明显改善作用，24h尿蛋白量较模型组显著下降(P<0.05或P<0.01)，联合组下降最为显著(P<0.01)；各药物组肾组织及尿MDA含量、肾组织SOD活性和血清TGFβ1表达与模型组有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，联合组与其他药物组比较差异显著(P<0.05)。光镜观察各药物组肾脏病理改变均有不同程度改善，各组间无明显差异。结论肾清饮对糖尿病大鼠肾脏有保护作用，与贝那普利联用有协同作用。其作用机制可能与抑制氧化应激和增强机体抗氧化能力，降低炎症因子TGFβ1的表达有关。【关键词】 肾清饮；糖尿病肾病；超氧化物岐化酶；丙二醛；转化生长因子β1　　ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatethepossibleprotectiveeffectofShenqingyinDecoctiononthekidneyofexperimentaldiabeticratsanditspossiblemechanism.MethodsTotally40ratsodelgroup,Shenqingyingroup,BenoprilgroupandShenqingyinBenoprilbinationgroup.After8ent,bloodglucose,renalfunctionand24hurineproteineasured,andmalondialdehyde(MDA)inrenaltissuesandurine,superoxidediamutase(SOD)activityandserumtransformedgroicroscopeasBUN,Screofallmedicinegroupsproved,thatincontrolgroup(P>0.05).Hoprovingeffectonbloodsugar.Thecontentof24hurineproteininallmedicinegroupsodelgroup(P<0.05orP<0.01),andShenqingyinBenoprilbinationgrouphadthesignificantlyloedicinegroups(P<0.01).MDAinrenaltissuesandurine,SODactivityandserumTGFβ1inallmedicinegroupssignificantlydifferedfromthoseinthemodelgroup(P<0.05orP<0.01),andShenqingyinBenoprilbinationgrouphadobviousdifferenceedicinegroups (P<0.01).Lightmicroscopyshoeliorationofdifferentdegreeinrenalpathologicalchanges,butedicinegroups.ConclusionShenqingyinDecoctionhasaprotectiveeffectonthekidneyofexperimentaldiabeticrats,andithassomesynergeticeffectechanismmayberelatedtoinhibitingoxidativestress,improvingthebodysantioxidantabilityanddecreasingtheexpressionofinflammatoryfactorTGFβ1.　　KEYDA);transformedgroedgrog/kg体重的剂量，给予高糖高脂组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ,Sigma公司产品)柠檬酸溶液。72h后将尾静脉全血血糖≥16.5mmol/L作为糖尿病模型造模成功的标准。正常对照组大鼠仅一次性腹腔注射等量的柠檬酸盐缓冲液(假造模)，并在假造模后采用相同方法测定血糖。　　1.2分组及给药　　32只造模成功大鼠随机分为4组，每组8只。其中肾清饮组给予肾清饮(由黄芪、地龙、当归、川芎、红花、桃仁、芍药、炙大黄等组成，由本院药剂科提供饮片并煎制浓缩)浓缩药液灌养[15g/(kg· d)]，贝那普利组给予贝那普利(每片10mg，诺华制药公司产品)混悬液灌养[10mg/(kg·d)]，肾清饮联合贝那普利组按单药物组剂量给药；对照组和模型组给予等量蒸馏水灌养。每日1次，连续给药8周。　　1.3样品的收集　　用药期间观察大鼠一般状况包括精神状态、行为、毛色、尿量、饮水量的变化，每周称量体重。8周时代谢笼收集24h尿液，待测24h尿蛋白及尿丙二醛含量。水合氯醛麻醉后大鼠心脏采血以测定血糖、血肌酐及尿素氮、TGFβ1含量。取双肾，去包膜，灌洗称重，右肾皮质以100mL/L甲醛固定，48h后逐级酒精脱水、石蜡包埋，切片4μm，常规HE和Masson染色，光镜下观察其病理学改变。左肾皮质在冰浴条件下，用冷生理盐水制备成100mL/L的匀浆液，保存于-20℃冰箱中。　　1.4测定指标　　血糖(BG)采用罗氏公司血糖仪测定，血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)和24h尿蛋白(UPRO/24h)采用日本OLYMPUSAU5400全自动生化分析仪测定。丙二醛(malondiadehyde,MDA)含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)检测，肾组织中超氧化物岐化酶(superoxidediamutase, SOD)活性检测采用上海产TG328电光分析天平，试剂盒均系南京建成生物工程研究所产品；采用酶联免疫吸附法检测血清转化生长因子水平的变化,试剂盒系比利时Bicsource公司产品。以上测定步骤严格按照试剂盒说明书进行。　　1.5统计学处理　　所有数据以(±s)和(M)表示，应用SPSS16.0软件包进行统计分析，数据符合正态方差齐性时组间比较采用单因素方差分析,当不符合条件时，采用秩和检验，且在两两比较时，校正检验水准。检验水准在方差分析时取0.05，秩和检验根据两两比较的次数加以校正。　　2结果　　2.1各组大鼠一般状况的比较　　造模后模型组大鼠逐渐出现毛发枯黄、精神萎靡、反应迟钝、尾巴苍白湿冷以及多饮、多食、多尿等症状，体型亦由原来的胖大转为明显瘦小，期间死亡2只。药物组大鼠第1周至第3周与模型组表现相似，期间死亡4只，用药1个月后，各治疗组大鼠精神好转，进食量逐渐正常，饮水量、尿量也随之正常。与模型组比较毛色明显转好，体重增加，自发活动亦明显改善。而正常对照组大鼠精神良好、活动频繁、毛发纯白光泽、饮水量及尿量均正常。　　2.2各组大鼠生化指标的比较 　　模型组及3个药物组大鼠第8周实验结束时血糖均明显高于对照组(P<0.01)，各药物组间无统计学差异；模型组血尿素氮、肌酐及24h尿蛋白明显高于对照组(P<0.01)，各治疗组尿素氮、肌酐较模型组显著下降(P<0.05或P<0.01)，与对照组无明显差异(P>0.05)，肾清饮及肾清饮联合贝那普利组更为显著(P<0.01)。肾清饮联合贝那普利组24h尿蛋白定量虽仍高于对照组(P<0.01)，但较其他药物组下降明显(P<0.01，表1)。表1各组大鼠生化指标的比较（略）　　2.4各组大鼠肾脏组织SOD活性和血清TGFβ1含量的比较　　模型组SOD活性明显低于对照组(P<0.01)，各药物治疗组SOD活性高于模型组，差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)，其中肾清饮联合贝那普利组SOD活性与对照组相比差异无显著性(P>0.05)；模型组大鼠血清TGFβ1水平明显高于对照组(P<0.01)，各药物治疗组TGFβ1水平明显低于模型组，差异具有显著性(P<0.01)，其中贝那普利组和肾清饮联合贝那普利组TGFβ1与对照组差异无显著性(P>0.05)，肾清饮组TGFβ1高于肾清饮联合贝那普利组(P<0.05，表3)。表3各组大鼠肾脏组织SOD活性和血清TGFβ1含量的比较（略）　　2.5大鼠肾组织的形态学变化 　　光镜观察对照组肾小球结构完整，无小球横截面面积增大，肾间质无异常；糖尿病模型组未见到肾小球弥漫性硬化及结节性硬化的典型改变，但肾小球稍增大，毛细血管内皮细胞增多，肾小球系膜细胞呈中度增生，毛细血管基底膜增厚，系膜区增宽。各药物组肾小球较糖尿病模型组病变有所减轻。Masson染色可见模型组肾小球、肾间质基质有明显沉积，而各药物组未见到上述变化，与对照组无明显差别(图1)。　　3讨论 较多研究资料表明，高糖、高脂膳食可成功制备胰岛素抵抗大鼠模型。在类似胰岛素抵抗大鼠的基础上加腹腔注射STZ诱导2型糖尿病肾病模型，肾脏随之而来的损害与时间成正比，且病理生理比较符合人类2型糖尿病肾病的特点，所以更适合用于DN早期防治措施的研究[3]。本实验采用此方法制备的动物模型生化指标与对照组有明显差异，但肾脏病理未见到肾小球弥漫性硬化及结节性硬化的典型改变，而仅见轻度的病理损害，也符合DN的早期研究。DN是糖尿病微血管病变的重要表现形式之一。高血糖及由此而导致的继发性代谢紊乱在DN的发病中起着关键的作用。血流动力学因素单独或与代谢因素一起激活肾内第二信使系统及氧化应激过程等。这些途径最终导致肾小球高滤过、高灌注、高压力状态，使白蛋白漏出增加、肾小球基底膜增厚和以肾小球系膜区为主的细胞外基质聚集，从而引起肾小球硬化和小管间质纤维化，促发DN。中医学对DN没有专门的论述，根据其发病特点等可归属于中医“消渴”及“水肿病”范畴。对其病因病机比较一致的看法是：血瘀证随糖尿病病程之迁延而上升，是DN发生的根源，气虚血瘀是DN贯穿始末的病理变化。现代研究发现DN中的微血管病变与DN有血瘀症者均有明显的血液高凝倾向[45]。用益气活血法既能补气行气又能活血化淤，从而达到治疗的目的。补阳还五汤乃益气活血，改善血流动力学的代表方剂[6]，出自清代王清任所著的《医林改错》，肾清饮是在该方基础上化裁而成，主要组成有黄芪、地龙、当归、川芎、桃仁、红花、生熟地、炙大黄等，起到活血化淤、益气补肾的功效。方中黄芪甘温，温阳益气，利水消肿，现代药理研究亦表明黄芪、当归可通过减少蛋白尿排泄、调节血脂和水钠代谢、减少人肾系膜细胞的增殖和IV型胶原的生成等作用，延缓慢性肾病向肾硬化进展[7]。另外，黄芪可通过降低脂质过氧化物的含量、提高超氧化物歧化酶的活性，从而减轻氧自由基对肾脏微血管的损伤[8]。大黄具有泻热通便，活血化瘀，凉血解毒的功效。现代研究显示，大黄酸可从多个方面防治DN的发生和发展[9]。本实验显示肾清饮与贝那普利对DN 大鼠的肾功能、24h尿蛋白和肾脏的病理改变均有明显的改善作用，二者联合作用更为明显。提示肾清饮对DN的肾脏保护作用，与众多研究证明的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)贝那普利对DN的保护作用相当[10]，二者联合应用可加强这种保护效应。但是，对大鼠血糖无明显改善作用。提示在DN的防治中血糖控制需应用降糖药物。　　在DN的发生和发展过程中，氧化应激所产生的过多机体反应性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)在糖尿病血管并发症中扮演首要和关键角色[1112]。ROS在肾系膜细胞中介导高糖和TGFβ1引起的PAI1mRNA及蛋白的表达和纤维蛋白溶酶活性的降低，进而使细胞外基质(ECM)沉积增多，参与DN上皮细胞间质转化而导致的肾小管间质纤维化。本实验通过测定氧化应激指标脂质过氧化产物MDA和机体清除体内超氧阴离子自由基的重要生物酶SOD，显示肾清饮、贝那普利均可减少DN大鼠肾组织和尿中MDA的表达，并提高肾组织中SOD的活性，二者联合作用更为显著。提示无论中药肾清饮还是ACEI类贝那普利均可降低高糖引起的氧化应激反应，减轻肾脏损害，从而达到保护肾脏的作用，贝那普利的作用与文献报道相一致[13 14]。在DN的发生和发展过程中，肾小球血流动力学改变、细胞外基质代谢、细胞增殖和细胞肥大等诸多方面，均有细胞因子的参与。TGFβ1是介导DN发生、发展最核心的细胞因子，可通过调节细胞增殖、分化和凋亡，介导肾脏胶原的沉积等途径而发挥作用[15]。本实验显示DN大鼠血清TGFβ1在模型组较正常对照组表达明显上升，与文献报道相一致；用药治疗8周后，各药物组的TGFβ1表达均有降低，肾清饮与贝那普利作用相当，二者联合能更大程度地抑制TGFβ1的产生。【参考文献】　　[1]郝亚宁，龚勇，尹爱萍.肾清饮对肾间质纤维化大鼠I型胶原及TGFβ1表达的影响[J].中国中西医结合肾病杂志,2009,10(1):2124.　　[2]郭啸华，刘志红，李恒，等.高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠模型及其肾病特点[J].中国糖尿病杂志,2002,10(5):290294.　　[3]刘毅，王宗保.糖尿病肾病动物模型的研究进展[J].中国实验动物学报,2006,14(1):6770.　　[4]史伟，黄立斌，孙文才，等.活血化瘀法治疗糖尿病肾病的概述[J].广西医学,2002,24(12):20042006. 　　[5]袁肇凯，黄献平，简亚平，等.高脂血症痰瘀症候与胰岛素抵抗的关系[J].中国医药学报,2003,18(8):468470.　　[6]唐海峰，周渭.补阳还五汤临床应用纂要[J].实用中医内科杂志,2009,23(4):2023.　　[7]余凌，李惊子，王海燕.黄芪、当归在肾脏疾病中的应用及其机制研究进展[J].中国中西医结合杂志,2001,21(5):396399.　　[8]成喜雨，崔馨，刘春朝，等.中草药抗氧化活性的研究进展[J].天然产物研究与开发,2006,18(2):514518.　　[9]张学亮，郭啸华，刘志红，等.大黄酸对低剂量链脲佐菌素肥胖糖尿病大鼠糖尿病肾病的影响[J].中华内分泌代谢杂志,2005,21(6):563565.　　[10]FORBESJM,COOPERME,THLLASV,etal.Reductionoftheaccumulationofadvancedglycation 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