粉尘螨磷酸丙糖异构酶克隆表达及过敏原性鉴定

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1、分类号R384.4密级学校代码10367UDC616编号学号20126831111粉尘螨磷酸丙糖异构酶克隆表达及过敏原性鉴定Cloningandexpressionoftriosephosphateisomeraseproteinfromdermatophagoidesfarinaandallergenicityidentification论文类别：学术研究型作者姓名万倩指导教师姓名钟政荣申请学位级别硕士学位授予单位蚌埠医学院学科专业临床检验诊断学研究方向病原生物论文答辩时间2015年5月学位授予日期2015年6月答辩委员会主席：论文评阅人：2015年5月硕士学位论文论文题目：粉尘

2、螨磷酸丙糖异构酶克隆表达及过敏原性鉴定Cloningandexpressionoftriosephosphateisomeraseproteinfromdermatophagoidesfarinaandallergenicityidentification研究生姓名:万倩指导教师:钟政荣学科专业:临床检验诊断学研究方向:病原生物论文工作时间:2013年3月至2015年4月学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，、数据和有关材料均是真。本论文中除引文外所有实验实的。本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机

3、构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究所做的贡献均己在论文中作了声明并表示了谢意。学位论文作者签名；日期：玄学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属骑培医学院。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可Ｗ借阅或上网公布本学位论文的、汇。部分或全部内容，可１＾采用影印、复印等手段保存编本学位论文学校可，允许论文被查阅和ｔｕ向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档借阅。（保密论文在解密后遵守此规定）：本学位论文属于保密论文，密级：保密期限为保密论文注巧年。学位论文作者签名：诚导师签名旅＾日

4、期：日期：＾护支．〇＾目录中文摘要………………………………………………………………………1英文摘要…………………………………………………………………2引言…………………………………………………………………………4材料与方法……………………………………………………………………………6结果………………………………………………………………………………25讨论…………………………………………………………………………………42结论…………………………………………………………………………………45参考文献……………………………………………………………………………46致谢……………………

5、……………………………………………………………49附录…………………………………………………………………………………50附录A缩略词表……………………………………………………………………50附录B个人简历及发表文章………………………………………………………52附录C综述………………………………………………………………………53粉尘螨磷酸丙糖异构酶克隆表达及过敏原性鉴定摘要目的:在原核表达系统中进行表达纯化重组磷酸丙糖异构酶蛋白，并对该蛋白进行过敏原性鉴定。方法:①提取粉尘螨总RNA并逆转录成cDNA，RT-PCR扩增粉尘螨磷酸丙糖异构酶基因；②将上述PCR产物与pUC57连接后，热

6、转化至E.coliTop10中，涂布于含氨苄霉素(100mg/L)的LB平板上，37℃培养过夜后从LB平板上挑选白色菌落放入LB培养液中扩大培养，提取质粒。用EcoRI和BamHI双酶切鉴定质粒，公司测序正确后进一步将酶切产物与pET-32a表达载体连接转化至E.coliBL21；③利用生物学软件进行磷酸丙糖异构酶生物信息学分析，根据软件分析计算所得的数据构造进化树；④IPTG诱导重组菌株表达；产物经变性、复性、Ni-NTA螯合层析和Superdex75凝胶过滤层析纯化；用Westernblotting实验检测重组磷酸丙糖异构酶的免疫原性；⑤收集4份来自广州医学院附属医院临床皮试的

7、粉尘螨过敏患者阳性血清和2份健康体检者血清样本，用Westernblotting、ELISA实验验证重组蛋白的过敏原性。进一步将重组磷酸丙糖异构酶蛋白进行人体皮肤点刺实验，检测44例人体皮肤点刺中磷酸丙糖异构酶蛋白的阳性率。结果：①结果成功构建重组的克隆载体和表达载体，PCR结果表明在预期位置出现与预期大小相一致特异性条带。②生物学软件分析磷酸丙糖异构酶是氨基酸数为247，分子质量为27134的疏水性蛋白。③SDS-PAGE结果显示，重组磷酸丙糖异构酶蛋白以包涵体的形