对粉尘螨过敏原蛋白derf3的活性鉴定研究

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1、对粉尘螨过敏原蛋白Derf3的活性鉴定研究　　前言　　尘螨可诱发过敏性皮炎、过敏性哮喘、过敏性鼻炎等过敏性疾病，且哮喘的发病率与尘螨的消长呈一定的比例关系。现已发现20多种尘螨过敏原组分，其中1、2组分占主要地位。但缺乏1、2组分的尘螨浸液仍能诱发哮喘，说明其它组分在致敏的过程中也发挥了重要作用。粉尘螨过敏原Derf3能够介导机体产生过敏反应，目前对其研究相对较少。因此，研制具有生物学活性的粉尘螨过敏原蛋白Derf3对揭示螨虫过敏的机制与规律具有重要的意义。本研究旨在利用原核表达体系重组表达过敏原

2、蛋白Derf3，利用特异性荧光底物Boc-Gln-Gly-Arg-MCA鉴定其酶学活性。另外，通过ELISA试验检测蛋白的免疫学活性，以期获得具有较高活性的目的蛋白，为生产高质量的诊断试剂和疫苗奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1菌种含有目的基因　　Derf3的菌种RosettapET44a-Derf3由本实验室构建保存。　　1.1.2患者血清试验　　所用血清来自广州医科大学附属第二医院过敏反应科的就诊患者(获得患者知情同意)血清入选标准：1)UniCAP过敏原筛查试验中粉尘螨过

3、敏程度4级以上(总IgE水平≥17.5KU/L)病人样本;2)病人出现粉尘螨过敏引起的一系列临床表现：如过敏性哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎等疾病的临床症状。阴性对照血清入选标准：UniCAP过敏原筛查试验中检测粉尘螨过敏阴性的样本(总IgE水平>50KU/L)。收集到的血清分装后置-20℃保存。　　1.1.3主要试剂和仪器　　StrepⅡ标签抗体购自Merck公司，StrepTrapHP预装柱为GEHealthcare公司生产，荧光底物Boc-Gln-Gly-Arg-MCA购自日本Pe

4、ptide公司，VarioskanFlash多功能酶标仪产于美国赛默飞世尔科技公司，TMB购自赛默飞世尔科技，PCR试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由上海博尚生物技术有限公司合成。　　1.2方法　　1.2.1表达质粒的鉴定　　以目的基因序列为模板设计引物，上游引物为5'GGAGATATACATATGGCTACACCGATTC3'，下游引物为5'CGTTTTGATTCAATCCAATCGACAAAATTACC3'，用以下PCR扩增程序鉴定表达质粒：预变性：95

5、℃5min;变性：95℃30s;退火：55℃30s;延伸：72℃40s(循环扩增30次);最后72℃延伸5min。用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。　　1.2.2目的蛋白的表达对PCR鉴定结果　　阳性的菌落按照1:100比例接种于Amp(50mg/L)抗性的LB培养基扩大培养，待细菌培养至对数期(OD0.6-0.8)时加入0.1mmol/LIPTG诱导表达4h。　　1.2.3目的蛋白的复性纯化与鉴定　　超声破碎诱导表达后的菌体，10000rpm4℃离心30min收集包涵体。按l:100的

6、比例将其溶解于8mol/L尿素结合缓冲液中(1结合缓冲液、8mol/LUrea、pH8.0)，室温搅拌溶解1h后离心，取上清装入透析袋，4℃条件下按照6mol/L、4mol/L、2mol/L、1mol/L、0mol/L的尿素浓度梯度透析(4h换一次液)，离心收集上清得到透析复性后的蛋白。用1结合缓冲液(1.5mMNaCl、100mMTris-HCl、1mMEDTA)平衡亲和层析柱后，将蛋白样品注入上样环，用洗脱缓冲液(2.5mmol/L脱硫生物素、1结合缓冲液、pH8.0)洗脱目的蛋白，收集洗脱峰

7、。目的蛋白经12%SDS-PAGE凝胶电泳(浓缩胶80V20min;分离胶160V40min)后转到PVDF膜上通过ini显像。　　1.2.4酶学活性的鉴定　　对Derf3蛋白原液按1:0、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32的比例进行稀释，分别取10μL蛋白样品加入2mL反应体系中(50mmol/LTris-HCl、pH7.4)，再加入3μL酶反应底物Boc-Gln-Gly-Arg-MCA使其终浓度为15μmol/L。反应条件为37℃水浴30min，用4mL15%乙酸终止

8、反应。最后，在380nm激发光波长及460nm散射光波长处检测荧光酶底物分解产物7-Amido-4-Methylcoumarin所释放的荧光，摸索该体系反应所需的最适蛋白量。为研究蛋白酶活性的影响因素，本研究开展了酶活性的抑制试验，即将目的蛋白样品稀释2倍后分为4管，每管100μL，一管置于56℃条件下水浴20min;一管加入1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)1μL;其余两管蛋白不作任何处理分别作为阴阳对照，反应体系和条件如前所述。　　1.2.5免疫学活性鉴定　　将