n-乙酰-d-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯化

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1、N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯化作者：余云彦，张卫星，闫欣欣，唐琴琴，刘乃华，晏永波，李校，林绍强【摘要】目的：从猪肾中提取RNA，从中克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(GNE)基因，并在大肠杆　菌E.coliBL21(DE3)中表达。方法：从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出GNE基因，经测序，感受态大肠杆菌E.coliDH5a转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(NiSepharose6FastFlow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。结果：RNA提

2、取物经紫外分光光度计检测OD260/OD280=1.77，说明无明显的蛋白质和酚污染。RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，　　编码402个氨基酸组成的酶蛋白(GNE)。SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45kD的单一条带，与基因序列推测值一致。结论：GNE基因已被成功地克隆和表达。【关键词】N-乙酰-D-萄糖胺-2-差向异构酶;基因;克隆;纯化;猪　Abstract:Objective:ToclonethegeneofN-acetyl-D-glucosamine-2-epimeraseaccordingtoRNAextractedfromp

3、igkidneyandexpressitinE.coliBL21(DE3)andthen12purifytheproduct.Methods:RNAwasextractedfromporcinekidneytoclonethegeneofN-acetyl-D-glucosamine-2-epimerasewithRT-PCRfollowedbysequencing.RecombinantplasmidwasconvertedintoE.coliDH5aandtoidentifyitfollowedbytheconversionoftherecombinantplas

4、midinE.coliBL21(DE3)andexpression.TheproteinwaspurifiedbyHis-tag(NiSepharose6FastFlow)，desaltedbyG-25columnandidentifiedbySDS-PAGE.Result:RNAwasextractedfromporcinekidneyandidentifiedwithultravioletspectrophotometer:OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(between1.7and2.2)，itshowedt

5、hattherewasnoproteinandphenolcontamination.AmplificationofGNEwithRT-PCR，thesequencelengthofGNEwas1206bpencodefor402aminoacids.Themolecularweightofpurifiedproteinwas45kDrevealedbySDS-PAGE，whichwasconsistenttotheanalysisbasedongenesequence.Conclusion:N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerasegen

6、eissuccessfullyclonedandexpressedinE.coliBL21(DE3).　　Keywords:N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase;gene;cloning;purification;pig12　　N-乙酰-D-神经氨酸(N-Acetylneuraminicacid，Neu5Ac)的酶法合成主要以N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)与丙酮酸为底物，在Neu5Ac醛缩酶(Neu5Acaldolase)的催化下生成Neu5Ac[1]。为克服ManNAc价格昂贵的问题，通过碱性条件[2]或使用N-乙酰-D-葡

7、萄糖胺-2-差向异构酶(GNE)使廉价的N-乙酰-D-葡萄糖胺转化为ManNAc[3]。用Neu5Ac醛缩酶，以ManNAc和丙酮酸为底物进行Neu5Ac酶法合成，已有多篇论文报道[4-6]。酶法合成具有转化率高、提取简单、产品纯度高[7]、环保等优点，鉴于醛缩酶可以从重组微生物中获得[8]，人们倾向于以此方法来生产Neu5Ac。1996年，Maru等人从猪肾中成功克隆出了GNE，该酶的克隆对两步酶法[9]生产Neu5Ac带来了希望，而GNE是酶法合成Neu5Ac最为关键的限速酶[10-11]。本研究从猪肾中克隆出GNE基因，将该基因克隆至表达载体pET28(b