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《重组人超氧化物歧化酶的基因克隆、表达及产物纯化研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、!"卷#期生物工程学报’()*!"+(*#$%%%年&月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12,-./-01-2$%%%!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!重组人超氧化物歧化酶的基因克隆、表达及产物纯化研究张翊王军志吴勇杰"（中国药品生物制品检定所北京!%%%#%）摘要为了克隆人,5676+8，构建表达载体，实现其在大肠杆菌中的高效稳定表达，通过抽提人肝组织总9+8，9:3;<9扩增人,5676+8，构建含2=,5676+8的表达质粒.>?34／2=,56，转化大肠杆菌@A!!
2、$#进行表达研究。结果克隆到的2=,5676+8序列与文献报道一致，在宿主菌中获得高效表达，表达水平达"BC以上；蛋白复性纯化工艺高效快速，2=,56纯品纯度达&BC以上，比活性达到$#$&D／0E；为用基因工程方法生产2=,56打下基础。关键词重组人超氧化物歧化酶，基因克隆，基因表达，包含体，复性，纯化中图分类号FB!"文献标识码8文章编号!%%%3G%"!（$%%%）%#3%##H3%4超氧化物歧化酶（,56）是机体内超氧自由基的!"%人&’()(*+的克隆及表达载体的构建天然清除剂［!，$］，对炎症、缺血再灌注损伤、辐射损取新鲜人肝组织B%0E，用:9IJ5>9-LE-K/抽伤均
3、有一定疗效，还可减少抗癌药物对细胞和心脏提总9+8，9:3;<9扩增2=,5676+8，参照,L03的毒副作用［G，4］。2=,56作为药物酶制剂，具有医［!%］构建含2=,5676+8的.T?34重组，构疫反应。近年来，美日等国已开发出基因工程产品，建表达质粒，转化大肠杆菌@A!!$#，构建成.>?34／并进入临床实验阶段。其临床适应症为早产儿氧中2=,56工程菌。毒引起的呼吸系统疾病
4、及神经系统疾病［#］。此外，!",-./0%／12&’(工程菌的发酵培养对2=,56在基因治疗及作为8I6,的辅助治疗等.>?34／2=,56工程菌菌种单克隆接种于>U8方面的研究也正在进行中［"，H］。我国除开展直接从种子培养液（!C:2V./(K-，%W#C?-LO/XY/2L7/，!C人血中提取,56外，也开展重组人,56的研+L<)，!%%!E／0>80.）。于G%Z恒温培养!$=，至究［B，&］。我们从人肝组织中克隆到人?34／2=,56工程菌种子菌液按76+8，并在大肠杆菌中得到表达。!／!%%（7／7）比例接种于4%%%0>发酵培
5、养液!材料和方法（%W%B0()／>+L$R;54，%W%$0()／>R$;54，%W%#0()／>+L<)，%W%$0()／>]E,54，!CQ)D7(O-，!"!菌株与质粒!C’M/0U!，%W!C+R4<)，大肠杆菌@A!!$#，质粒.>?34由上海医科大学%W!C/2L7--)-0-K/O()D/M(K，.R"WB），于#>生物反宋后燕教授惠赠。应器（UM(N)(III*+U,*<(*T,8）中发酵培养。G%Z!"#主要试剂扩增，4$Z诱导培养。离心收集.>?34／2=,56工程:9IJ5>9-LE-K/购自>MN-:-7=K()(EM-O公司；
6、菌。经,6,3;8QX电泳分析后，^$%Z保存。9:3;<9试剂盒购自;2(0-EL公司；其它工具酶均购自>MN-:-7=K()(EM-O公司。!"3-./0%／12&’(工程菌破菌及包涵体（45)6789:5;:<=&:67>9:5，4;&）提取纯化!"$引物设计与合成正向引物：#P⋯8::Q88::<8:QQ?34／2=,56工程菌悬浮于破菌缓冲液反向引物：#P⋯8::QQ8:<<::8::QQQ;U.RHW4，%W!#0()／>+L<)），于高压引物两端分别设计30(9I和.+4RI位点。匀质机（8;’*<(
7、T）#%%SE／70$，破菌。涂片，革收稿日期：$%%%3%!3$4，修回日期：$%%%3%"3!$。"兰州医学院药理学教研室。生物工程学报E?卷99X兰氏染色镜检，破菌率!"#以上。离心收获$%&，悬浮于破菌缓冲液，以’()*+,匀浆器（-+..(/012)2(345067）反复匀浆研磨$%&，以去除可溶性核酸及菌体膜蛋白等杂质。离心收获纯化的$%&。!"#$%&’(蛋白的提取及复性纯化后的$%&溶解于$%&溶解缓冲液（"8"97+)／:-
