抗cd133纳米抗体的制备及细胞毒性肽的活性分析

《抗cd133纳米抗体的制备及细胞毒性肽的活性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、硕士研究生学位论文新疆大学论文题目（中文）：抗CD133纳米抗体的制备及细胞毒性肽的活性分析论文题目（英文）：Preparationofanti-CD133nanobodiesandinvitroassessmentofthecytolyticpeptidesanti-tumoralactivity研究生姓名：翟田甜学科、专业：生物学研究方向：生物化学与分子生物学导师姓名职称：李江伟教授论文答辩日期：2015年5月26日学位授予日期：2015年月日XinjiangUniversityMasterDegreeDissertationPre

2、parationofanti-CD133nanobodiesandinvitroassessmentofthecytolyticpeptidesanti-tumoralactivityMasterDegreeCandidate:TiantianZhaiMajor:BiologyOrientation:BiochemistryandMolecularBiologySupervisor:Prof.JiangweiLiXinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering

3、,TheCollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi,ChinaMay26,2015新疆大学硕士学位论文摘要目前倾向于认为肿瘤干细胞是恶性肿瘤难治和对化疗耐药的根源之一。因此，对肿瘤干细胞表面标志分子的鉴定和功能研究，以及开发基于这些分子的靶向药物成为提高肿瘤治疗效果的手段之一。CD133是一个五次跨膜糖蛋白，在多种恶性肿瘤细胞以及肿瘤干细胞表面高表达，是鉴定肿瘤干细胞最常用的标志物之一。目前获得的抗CD133的抗体包括AC133、293C3和AC141等主+要用

4、于鉴别CD133表达的干细胞亚群，并不具有对肿瘤干细胞的治疗作用。因此，有必要开发靶向CD133并具有治疗作用的新抗体药物。由于当前对CD133分子在干细胞中的生物学功能不甚了解，对设计靶向CD133的功能性抗体带来了困难。所以，当前靶向CD133治疗抗体的主要策略是与细胞毒性药物进行偶联。其中一种方法是与细胞毒性肽，如大肠杆菌毒素分子（ColicinIa）、蛙皮素抗菌肽（Brevinin-2R）、假单胞菌外毒素A-PE38以及KDEL肽，进行分子融合或偶联。另外，直接在抗体分子上偶联毒性更强的化疗药物，如单甲基澳瑞他汀等，越来越成为制

5、备抗体-药物偶联物的主要趋势。已有研究表明，这些细胞毒制剂与抗CD133抗体融合可以显著地抑制多种肿瘤组织及肿瘤干细胞的生长。纳米抗体是在骆驼科动物免疫系统中发现的天然缺失轻链的重链抗体可变区片段，是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子，具有水溶性高、制备成本低和可结合常规抗体不易结合抗原表位等优点。在制备抗体-药物偶联物中，因纳米抗体的单域抗体特性，偶联药物后对其抗原结合活性影响甚微。这使得纳米抗体在制备抗体-药物偶联物中更具优势。因此，本研究的目的在于获得高亲和力的抗CD133的纳米抗体并与ColicinIa蛋白或Brevini

6、n-2R分子进行偶联或分子融合制备抗体-毒素复合物，以期将抗体的靶向作用与毒素分子的抗肿瘤作用结合起来，从而获得一种对肿瘤及其干细胞具有显著杀伤作用的治疗制剂。基于此，本研究首先采用DNA重组技术构建包含CD133胞外区（CD133-ECD）的原核表达载体pET28a-CD133-ECD。利用IPTG诱导表达CD133-ECD蛋白，采用Ni-离子亲和色谱纯化诱导表达的CD133-ECD蛋白。将纯化蛋白对新西兰兔和新疆双峰驼进行免疫，以获得兔源和骆驼源抗CD133-ECD蛋白的多克隆抗体，用于分析抗体对CD133蛋白的结合情况。其次，从新

7、疆双峰驼骆I新疆大学硕士学位论文驼外周血淋巴细胞中提取总RNA，构建骆驼纳米抗体噬菌体展示文库，并用纯化的CD133-ECD蛋白对噬菌体展示文库进行亲和筛选以得到对CD133-ECD有结合力的候选抗体。进一步，采用ELISA和Westernblot方法对获得的候选纳米抗体的抗原结合活性进行鉴定。最后，采用细胞增殖实验对重组表达获得的ColicinIa和Brevinin-2R毒性蛋白分子对B16细胞、Skov-3细胞和Caov-3细胞的生长抑制作用进行检测，为将来制备抗体与细胞毒性肽的偶联或融合物提供实验基础。结果表明，原核表达载体pET

8、28a-CD133经过诱导表达，获得了纯度大于90%的CD133-ECD重组蛋白，从免疫的家兔和骆驼血清中获得了效价分别为1:500000和1:1024000的抗CD133-ECD多克隆抗体。两种多抗在EL