抗EGFR纳米抗体的制备及其活性研究.pdf

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1、犬ｉｔ嫂－大學ＤＡＬＩＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ硕士芽位文ＭＡＳＴＥＲＡＬＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ抗ＥＧＦＲ纳米抗体的制备及其活性研究生物化工学科专业宋晓链作者姓名指忌救肺贾凌云教授答辩日期２０１５年６月大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文巳经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体巳经发表的研究成果，也不包含其他巳申请学位或其他用途使用过的成果一。与我同

2、工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题＇目：政以摘表政／制备ｄＡ本鄉作者签名日期：年乂月广日／大连理工大学硕士学位论文摘要抗表皮生长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）的纳米抗体由于具ｇ有相比普通单克隆抗体更优异的溶解性、稳定性、渗透性和易于融合表达并且获得多价抗体等优点，在肿瘤的临床诊断和治疗方面具有重要的潜在应用价值。然而，大规模获得有活性的抗ＥＧＦＲ纳米抗体仍然是目前研究中

3、的难点，是其广泛应用的重要制约因素。本研究通过进行基因序列改造、诱导表达和分离纯化获得了高纯度的５种抗ＥＧＦＲ纳米抗体的包涵体，随后通过优化包涵体的复性条件显著提高了纳米抗体的产率。又通过综合评价复性纳米抗体的结合活性和癌症细胞表面受体识别能力证实了获得的纳米抗体具有高活性。论文的研究内容包括：（１），在大肠杆菌（Ｅｓｃｈｉｉ抗ＥＧＦＲ纳米抗体的诱导表达：通过基因工程技术＾ｅｒｃｈａｃｏｌｉ，ＫｃｏＵ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行了５种抗ＥＧＦＲ纳米抗体的原核表达。通过比较诱导剂°ＩＰＴＧ的加入浓度，加入时间及诱导时间，最终确定

4、纳米抗体的最佳表达条件为３７Ｃ，ＩＰＴＧ加入时间为菌种开始培养４ｈ后，加入量为０．４ｍＭ，诱导表达４ｈ，最终可使抗ＥＧＦＲ纳米抗体的表５％－ＰＡＧＥ达量占总蛋白的２。通过ＳＤＳ进行目的蛋白的可溶性检测得知，表达的纳米抗体主要以包涵体形式存在。（２）抗ＥＧＦＲ纳米抗体的分离纯化及包涵体复性：本研究通过在抗ＥＧＦＲ纳米抗体Ｃ端加入６个Ｈ，ｉｓ标签并使用金属离子螯合层析法，梯度增强咪挫浓度ＵＯＯｍＭ咪唑、３００ｍＭ咪挫）洗脱，显著提高了抗ＥＧＦＲ纳米抗体的纯度，５种纳米抗体的最终纯度均在９０％以上。通过使用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法和细

5、胞Ｅｌｉｓａ对透析复性和稀释复性的可溶一性蛋白收率和纳米抗体活性进行了比较评价，最终釆用稀释复性的方法，并进步对影响稀释复性的６种参数（初始蛋白浓度、稀释液滴加速率、复性ｐＨ、添加剂种类、精氧酸浓度、还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比例）进行考察，确定最佳的稀释复性条－＝件为：初始蛋白浓度．３０．４ｍ／ｍＬ，复性Ｈ８，：０ｇ．０添加２００ｍＭ精氨酸及比例为５１：ｐ的还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽，包涵体复性率为７３％，纳米抗体最终得率为３８％。（３）抗ＥＧＦＲ纳米抗体活性评价及作用ＩＥ点研宄：本研宄通过使用细胞Ｅｉ的方ｌｓａ法评价

6、了所获得的５种纳米抗体的结合活性，最终确定所获得的５种抗ＥＧＦＲ纳米抗体均具有抗原结合活性且纳米抗体Ｃ活性最高一。进，并步通过间接免疫劳光技术和ＭＴＴ法确认了所获得抗ＥＧＦＲ纳米抗体能够识别表皮癌细胞Ａ４３１表面ＥＧＦＲ受体，并且能够与ＥＧＦ竞争结合ＥＧＦＲ受体，显著抑制肿瘤细胞的增殖（浓度为５ｐｍｏｌ／Ｌ时的增殖抑制率达７５％）小抗ＥＧＦＲ纳米抗体的制备及其活性研究综上所述，本研究所提出的制备和纯化方法使得快速，方便并且大规模获得具有髙活性的抗ＥＧＦＲ纳米抗体成为了可能，对未来的基于纳米抗体的生物识别和给药研究打下了

7、良好的基础，并且对于抗ＥＧＦＲ纳米抗体的作用机理研究和相关的临床诊断及治疗应用具有重要的实践意义。关键词：抗ＥＧＦＲ纳米抗体分离纯化；复性；乾向识别；－－ＩＩ大连理工大学硕士学位论文Ｔｈｅｒｅａｒａｔ－ｉｏｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉＥＧＦＲｎａｎｏｂｏｄｙｐｐＡｂｓｔｒａｃｔＡｎ－ｔｉＥＧＦＲｎａｎｏｂｏｄｈａｓｏｔｅｎｔｉａｌｖａｌｕｅｉｎｃａｎｃｅｒｄｉａｎｏｓｉｓａｎｄｔｈｅｒａｅｕｔｉｃｓｆｏｒｉｔｓｙｐｇｐｂｅｔｔｅｒｓｏｌｕｂｉｌｉｔ，ｓｔａｂｉｌｉｔａｎｄ

8、ｅａｓｉｎｅｓｓｔｏｅｘｒｅｓｓｉ