抗cd47纳米抗体的制备和鉴定

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1、硕士研究生学位论文新疆大学论文题目（中文）：抗CD47纳米抗体的制备和鉴定论文题目（英文）：Preparationandidentificationofanti-CD47nanobodies研究生姓名：贾二坷学科、专业：生物化学与分子生物学研究方向：基因工程抗体导师姓名职称：李江伟教授论文答辩日期：2015年5月26日学位授予日期：2015年月日XinjiangUniversityMasterDegreeDissertationPreparationandidentificationofanti-CD47nanob

2、odiesMasterDegreeCandidate:JiaErkeMajor:BiochemistryandMolecularBiologyOrientation:GeneticEngineeringAntibodySupervisor:Prof.LiJiangweiCollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,ChinaMay,2015新疆大学硕士学位论文摘要CD47是一种广泛表达的膜蛋白，也称为整合素相关蛋白(IAP)。作为

3、巨噬细胞和髓样细胞表面的信号调节蛋白α（Signalregulatoryproteinalpha,SIRPα）的配体，其与SIRPα的相互作用，对吞噬细胞提供了负调控信号，抑制了巨噬细胞的吞噬作用。近年来，发现CD47在白血病、淋巴瘤和几乎所有实体瘤中均高表达，CD47-SIRPα信号的激活抑制了吞噬细胞对肿瘤的清除作用，成为肿瘤逃逸免疫监视的机制之一。采用抗体或拮抗剂阻断CD47-SIRPα信号通路，从而恢复免疫细胞功能，成为抗肿瘤免疫治疗的新策略。食管癌是新疆地区高发癌症之一，其对常规化疗具有耐药性并且预后不良

4、，需要发展新的治疗策略。目前，还没有研究报道食管癌细胞是否表达CD47，也没有靶向CD47治疗食管癌的报道。纳米抗体是骆驼中天然缺失轻链的重链抗体的可变区片段，是目前最小的具有完全抗原结合功能的单域抗体。因其具有分子小、组织穿透能力强、易于结合蛋白裂隙表位和生产成本低等优点，已经成为开发新一代治疗抗体很有希望的候选分子。本研究的目的主要有两方面，一是通过CD47单抗对食管癌的作用，初步评价CD47作为抗食管癌细胞作用靶点的价值；另一方面是建立双峰驼天然VHH噬菌体文库，通过噬菌体展示技术，筛选和获得抗CD47纳米抗

5、体，为今后开展纳米抗体抗肿瘤作用研究提供基础。本研究主要包括以下两部分内容：1.抗CD47单克隆抗体对体外食管癌细胞的抗肿瘤作用研究首先采用RT-PCR、流式细胞术、Western-Blot和细胞免疫荧光等检测食管癌细胞表面CD47的表达。其次，采用小鼠巨噬细胞体外吞噬实验检测抗CD47单克隆抗体（B6H12）对食管癌的抗肿瘤作用。采用CFSE对食管癌细胞进行荧光标记。食管癌细胞增殖和凋亡分别采用CCK-8和AnnexinV-FITC用流式细胞仪检测。结果表明，所有检测的食管癌细胞与Vero细胞相比CD47表达差异

6、显I新疆大学硕士学位论文著；其中EC9706和KYSE150细胞CD47的表达显著高于Eca-109细胞。对EC9706和KYSE150进行的细胞增殖和吞噬实验结果显示，抗CD47单抗（B6H12）处理后的细胞系，细胞增殖受到明显的影响，与IgG1同种型抗体相比，差异显著（p<0.05）。将小鼠巨噬细胞与CFSE标记的EC9706和KYSE150细胞共孵育，抗CD47单抗（B6H12）与IgG1同种型抗体相比，小鼠巨噬细胞对食管癌细胞EC9706和KYSE150的吞噬作用明显增强，差异极显著（p<0.01），且吞噬

7、指数达0.2。这些结果表明食管癌细胞系（EC9706和KYSE150）高表达CD47，抗CD47单抗能够促进巨噬细胞对所研究的食管癌细胞的吞噬作用，为靶向CD47治疗食管癌提供依据。2.噬菌体展示技术筛选和鉴定抗CD47纳米抗体首先采用DNA重组技术制备CD47蛋白。以人CD47基因全长cDNA克隆为模板，PCR扩增CD47胞外区基因片段，构建pET30a-CD47重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达经镍离子纯化，利用抗CD47单抗进行鉴定。将纯化蛋白对新疆双峰驼进行免疫，获得骆驼抗CD47蛋白的多克隆抗体，用于分析抗体

8、对CD47蛋白的结合情况。其次，采用噬菌体展示技术制备纳米抗体。从采自5头骆驼的外周淋巴细胞中提取RNA反转录cDNA为模板扩增VHH基因片段，经过PstI/NotI双酶切后连接到pMECS载体上，电转化TG1大肠杆菌细胞形成VHH天然抗体文库。VHH噬菌体展示文库采用M13KO7辅助噬菌体超感染、扩增以及PEG8000沉淀纯化获得。采用亲和淘洗方法，在EL