抗cmtm4多克隆抗体的制备、 纯化和鉴定

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1、抗CMTM4多克隆抗体的制备、纯化和鉴定：李婷,郭晓欢,王彧,MarkusPlate,邵陆宁,宋泉声,马大龙,韩文玲【摘要】　　目的:制备抗CMTM4的多肽抗体并鉴定其性能。方法:通过TMHMM、DNAStar等软件对CMTM4的3种剪接体,CMTM4v1,v2和v3的蛋白序列进行分析,选取了4段序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素（KLH）偶联。其中第1、2、3条多肽为3种剪接体共有,混合后免疫家兔,制备Ab1;而第4条多肽为CMTM4v1所特有,单独免疫家兔,制备Ab2。ELISA法检测抗体效价。免疫亲和层析法纯

2、化后,进行TM4多肽抗体Ab1和Ab2,效价分别达1∶105和1∶106。纯化后的Ab1用于TM4v1和v2,并可用于免疫组织化学实验;而Ab2仅可用于TM4v1。Ab1还可特异识别小鼠内源性Cmtm4。结论:用多肽免疫家兔制备的2种抗CMTM4抗体不仅具有较高的效价以及特异性,并且Ab1还可以特异识别小鼠Cmtm4,为CMTM4的功能研究提供了有力的支持。【关键词】CMTM4多肽抗体免疫亲和纯化　　[Abstract]AIM:Toprepare,purifyandcharacterizethepolyclo

3、nalantibodiesagainstCMTM4.METHODS:Fourpolypeptidesnamedpeptide1,2,3,and4aticsanalysisofthethreeisoformsofCMTM4,CMTM4v1,v2,andv3,andcoupledpethemocyanin(KLH)forimmunization.Amongthem,peptide1,2,and3,monforCMTM4v1,v2,andv3,ixedforimmunizationtopreparetheant

4、ibodys(Ab1);munoaffinitychromatography,Ab1andAb2munohistochemistryassays.RESULTS:ThetitersofAb1andAb2edtheirhighspecificity.Ab1couldalsobeusedforimmunohistochemistryanalysis,butAb2couldnot.ImmunohistochemistryanalysisonstratedthehighexpressionlevelofCMTM4inhu

5、mantestis,munohistochemistryanalysisverifiedthatAb1canalsorecognizemouseCmtm4.CONCLUSION:TanCMTM4munoaffinitychromatographypurification　　趋化素样因子（chemokinelikefactor,CKLF）和趋化素样因子超家族成员18（chemokinelikefactorsuperfamilymember18,CKLFSF18）是本研究室在国际上首次报道的一个新基因家族,

6、其编码产物的结构和功能特点介于经典的趋化因子与4次跨膜蛋白之间[1,2]。由于该家族大部分成员存在不同剪接体,且每个基因至少有一种剪接体的编码产物具有MARVEL结构域,因此,2005年12月,CKLFSF18被国际人类基因命名委员会（HUGO）重新命名为CMTM18（CKLFlikeMARVELtransmembranedomaincontainingmember18）。　　CMTM4有3种剪接体,CMTM4v1、v2和v3,分别编码234、208和179个氨基酸;其中CMTM4v1和v2是主要形式

7、,在多种组织中广泛表达;而CMTM4v3仅存在于部分肾脏组织和胎盘组织中。CMTM4v2是该基因全长cDNA产物;目前,在小鼠中仅发现了Cmtm4v2（简称小鼠Cmtm4）,其氨基酸序列与人CMTM4v2同源性高达95.7%。CMTM4v1蛋白羧基端比v2多26个氨基酸。为了进一步研究CMTM4的生物学功能,我们设计了CMTM4多肽,免疫家兔,制备多肽抗体;通过免疫亲和层析方法,对其进行纯化;利用偶联的二抗购自LICORBIOSCIENCE公司。弗氏佐剂购自Sigma公司。正常羊血清工作液、真核细胞表

8、达载体pcDNA3.1/MycHisB()购自Invitrogen公司;真核细胞表达质粒pcDNA3.1/MycHisB()CMTM4v1和pcDNA3.1/MycHisB()CMTM4v2为本实验室构建。　　1.2方法　　1.2.1生物信息学分析及CMTM4多肽的设计利用TMHMM（.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）软件