单抗的制备、纯化和鉴定

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1、单抗的制备、纯化和鉴定单抗的制备、纯化和鉴定一、实验目的:单克隆抗体制备是细胞免疫学的-•个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方而内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能人量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产牛特界性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞-与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，乂具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在IIAT培养基［含有次黄喋吟(I

2、I)、如基喋吟(A)和胸腺喘碇核苜(T)］中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融介的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基小的氨基蝶吟阻断，又因缺乏次黄瞟吟-鸟瞟吟-磷酸核糖转移酶(HGPRT),不能利用培养基屮的次黄噪吟完成DNA的合成过程而死亡。只有融介的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嚓吟-鸟嚓吟-磷酸核糖转移酶，凶此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，对筛选出能产生特升性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平血、酶标

3、仪、加样器、细胞计数板、C02培养箱、倒置显微镜等。四、操作方法：1抗原制备;•般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。A.可溶性抗原(蛋白质)以lmg/ml〜5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml〜0.6ml,间隔3〜5周再同样注射一次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉(尾静脉)给予无佐剂抗原0.2ml~0.4ml,3~4天后，杀死小鼠取脾做融合用。B.颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊

4、红血球免疫小门鼠，以1%浓度每只皮下注射0.2nd,每周2次，共免疫5〜8次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫动物;L!前应用最广的是小门鼠和大白鼠，尤以小门鼠为好。就品系而言以Balb/c小门鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以旷12周龄为宜。大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠一人鼠，小鼠一人以及人一人杂交瘤技术。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能

5、得到所需要的单克隆抗体的关键Z-0正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.OX107~5.0X107种不同的抗体。因此一只正常的小门鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分Z—的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞人量增加。B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很人影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后厂8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天

6、应杀鼠取脾做细胞融合。3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；脾细胞制备(1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或川C02处死小门鼠。(2)将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。(3)把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。(4)用锡了轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。(6)以2.5%FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min〜lOmin(与此同时应开始制备骨髓细

7、胞)。(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。(8)重复⑹、⑺步骤。(9)计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检杳，活细胞数应高于80%为合格。骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋门，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的來源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髄瘤细胞必须是静息状态，不产生Y球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度，瑕好106个细胞/ml；④生长速度快

8、，繁殖时间短。目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有:©S194/5XX0•BU•1；②SP2/0—Agl4（简称SP2）；③P3/X63-Ag8.653（X63-Ag8.653）（简称653）：④FO以653最为常用，它是由