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1、兔抗凋亡蛋白酶活化因子1多克隆抗体的制备、纯化与鉴定作者:张文,刘红军,胡志军,高琰,高志涛,王辉【关键词】凋亡蛋白酶活化因子1;多克隆抗体 1997年,Zou等[1]首次从HeLa细胞胞质内纯化和克隆出凋亡蛋白酶活化因子1(apoptoticproteaseactivatingfactor1,Apaf1)的cDNA,该蛋白质的相对分子质量(Mr)为130。近来研究发现在细胞色素C和dATP存在的情况下,Apaf1可聚集成凋亡体(apoptosome)[2],凋亡体负责将半胱天冬酶9酶原蛋
2、白(procaspase9)裂解成半胱天冬酶9(caspase9),以及维持caspase9的酶活性,进一步激活caspase3而诱导细胞凋亡[2],因此Apaf1可被认为是凋亡体的真正核心。为了深入研究Apaf1在细胞凋亡中的重要作用,我们根据美国NCBI数据库中Apaf1氨基酸的序列,通过软件分析获得表位序列,然后人工合成抗原肽,免疫新西兰家兔制备Apaf1多克隆抗体。 1材料和方法 1.1材料新西兰大白兔雌性2只(体质量1.9~2.1kg),购自郑州大学实验动物中心。Jurka
3、tE641细胞系购自美国ATCC公司。食管癌组织取自新乡市中心医院。抗原肽KLH由上海华大天源生物科技公司合成。CNBr活化的Sepharose4B购自美国Pharmacia公司。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司。兔抗人Apaf1抗体购自北京博奥森公司,酶标羊抗兔IgG抗体、免疫组化染色试剂盒和Westernblot试剂购自武汉博士德公司。 1.2方法 1.2.1抗原肽的设计从美国NCBI网站上获得Apaf1(NM_001160)蛋白的氨基酸序列,含有1194个氨基酸,然后将
4、该序列用Proteinlounge网站的peptidefinder软件进行分析获得有效的Apaf1抗原肽。 1.2.2多克隆抗体的制备将合成的Apaf1抗原肽KLH与弗氏完全佐剂混合,在新西兰兔背部行皮内多点注射,抗原剂量为每只100μg/次。2周后以相同方法进行第2次免疫(抗原剂量减半,弗氏不完全佐剂),之后每隔3~4周加强免疫1次,并于加强免疫后7~10d采血,用ELISA法测定血清中抗体的效价。最后1次免疫后8d,颈动脉插管放血,分离血清,置-20℃保存备用。 1.2.3多克隆抗体的纯化取
5、1g活化的琼脂糖(CNBRsepharose4B)加入5mL的1mmol/LHCl浸泡30min,然后用20mL1mmol/LHCl洗,最后用35mL的0.1mol/LpH9.0NaHCO3-0.5mol/L4NaCl洗。将处理好的琼脂糖和20mg抗原在7mL0.1mol/LpH9.0NaHCO3-0.5mol/LNaCl液中混合偶联,4℃缓慢搅拌过夜。将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内,将1.5mL血清中加入6mL0.1mol/L,pH8.0的PBS,然后上柱,用0.01mol/LpH8.0PBS液洗柱
6、,流速为1mL/min。最后加0.1mol/LpH2.8甘氨酸HCl缓冲液,洗脱,收集解吸附下来的成分,立即以1mol/LNaHCO3中和,以免蛋白变性。将收集液用0.01mol/LpH7.4PBS(含0.2g/LNaN3)透析过夜。 1.2.4多克隆抗体的特性鉴定①效价测定: 采用间接ELISA法。以合成的Apaf1抗原肽(2mg/L)包被ELISA板,每孔加入100μL,4℃过夜。用洗涤液洗3次后,加入10g/LBSA室温封闭4h。甩干后,依次加入倍比稀释的兔抗血清(37℃30min,洗5次)、
7、1∶10000的HRP羊抗兔IgG(同上孵育及洗涤)。最后加TMB底物液显色,终止反应后,读取A450值。②Westernblot参照文献[3]取培养的JurkatE61细胞,裂解提取蛋白进行SDSPAGE电泳,然后转移至硝酸纤维素滤膜上,以50g/L脱脂奶粉室温封闭后,分别依次滴加1∶2000的纯化兔抗Apaf1抗体、阳性对照抗体(购买的Apaf1抗体)及1∶10000的HRP羊抗兔IgG。最后加入化学发光试剂,用X线片显影、定影。③免疫组化: 取食管癌组织进行石蜡包埋、切片,50g/LBS
8、A封闭,然后滴加1∶500稀释的纯化兔抗Apaf1抗体、阳性对照抗体和免疫前的兔血清,4℃过夜,其余按照试剂盒说明操作。最后苏木素轻度复染,封片。显微镜观察。4 2结果 2.1Apaf1抗原表位分析结果通过软件分析获得5条抗原表位多肽,长度均为15个氨基酸(表1)。其中以40EEKVRNEPTQQQRAA54为最佳,便合成此段多肽与载体钥孔戚血蓝素(Keyholelimpethemocyanin,KLH)偶联成完全