抗呕吐毒素多克隆抗体的制备、 纯化及鉴定

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1、抗呕吐毒素多克隆抗体的制备、纯化及鉴定：张银志,王俊双,孙秀兰【摘要】　　目的:制备呕吐毒素（DON）的多克隆抗体,并对抗体效价、特异性和抑制率进行鉴定。方法:采用EDC法合成了呕吐毒素的完全抗原DONBSA,并通过免疫新西兰大白兔,得到呕吐毒素的多克隆抗体。结果:ELISA检测出多抗中含有呕吐毒素的特异性抗体,其效价最高为12800,其抑制率为50%时,DON的浓度为10mg/L,DON的最低检测浓度为0.1mg/L。与结构类似物T2毒素和NIV的交叉率分别为9.1%和4.9％。结论:呕吐毒素经过衍生化后制备出完全抗原,经免

2、疫新西兰大白兔后得到的多克隆抗体可以完全满足ELISA检测的需要。【关键词】呕吐毒素;多克隆抗体;鉴定　　呕吐毒素(vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol;DON))［1］,化学名为3α,7α,15一三羟基草镰孢菌9烯8酮,属单端孢霉烯族化合物。DON主要由禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）和黄色镰刀菌（Fusariumculmorum.）产生,广泛存在于霉变的小麦、大麦、玉米等谷物籽实中,具有急性毒性、免疫毒性和胚胎毒性等危害［2-4］。目前国内关于DON的检测方法,主

3、要包括薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、LCAPCIMS和免疫学检测方法。免疫学检测方法具有特异性强、灵敏度高、实验操作较简单等优点,广泛应用真菌毒素检测。目前国内有少数几家公司生产用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒,但生产中的主要试剂DON的完全抗原和多克隆抗体基本来自于国外,价格昂贵。我们在本实验室合成了DON免疫抗原和检测抗原的基础上,制备了DON多克隆抗体,对抗体效价和特异性进行检测,研究结果为建立呕吐毒素的免疫检测方法奠定了基础。　　1材料和方法　　1.1材料酶标仪、洗板机和可调试

4、移液器为ThermoLabsystem公司;冷冻离心机为Allegra公司;冷冻干燥机为Labconco公司;微量可调移液器:Finnpipette公司;96孔和16孔酶标板:Corning公司。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、弗氏不完全佐剂(ICFA)、弗氏完全佐剂(CFA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)均购自于Sigma公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（HRPIgG）、1乙基3(3二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)四甲基联苯胺（TMB）上海生工生物技术服务工程公司;Tg、NHS1.38mg,

5、并分别溶于100μL的DMF中,待用。（2）分别称取4mgBSA和MBSA溶于200μL,0.01mol/LpH7.4PBS中,冰箱中冷藏待用。将DON衍生物溶于350μL的DMF中,将NHS溶液加入,并在搅拌的同时缓慢加入DCC溶液,混合物在4℃避光反应2h,经离心提取上清夜,然后在搅拌的同时缓慢滴加BSA（或MBSA）溶液,4℃下缓慢搅拌反应20h。（3）将产物溶液用0.01mol/LpH7.4PBS溶液在4℃下透析72h,每12h换透析液1次,溶液用小瓶分装,真空冷冻干燥后,在4℃保存。制备包被抗原所用的蛋白为OVA,方法与

6、免疫抗原相同［5-8］。　　1.2.2抗血清的制备选3只健康新西兰雄性大白兔,取其中1只作为阴性对照,剩余2只为实验组。初次免疫时,将DONBSA冻干粉用生理盐水溶解,用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量,配成1g/L的溶液。将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其充分乳化好后,于实验动物背部皮下多点注射,1mL/只。初次免疫后的免疫称为加强免疫,加强免疫用福氏不完全佐剂乳化,第1次加强免疫于足下注射,以后的加强免疫于肌肉多点注射,每2周加强免疫1次,剂量与初次免疫相同。第2次加强免疫后,每隔2周耳缘静脉取血测定效价变

7、化,4次加强免疫后从耳缘静脉采血,采用间接酶联免疫法测定抗血清效价。待效价达到要求后,单独用免疫原冲击免疫1次,7d后采用颈动脉取血获得抗血清,收集于50mL灭菌塑料离心管中,备用。　　1.2.3纯化塑料离心管倾斜,与水平成50°于室温下静置4h,待血液凝固后,于4℃冰箱过夜,血清自然析出。将血清吸出后,3000r/min离心15min,取上清,与前面吸出的血清混在一起,再以4000r/min离心10min,然后加入0.2g/L叠氮钠和500mL/L甘油,分装,-20℃保存备用。　　1.2.4效价测定采用饱和硫酸铵二次沉淀法纯化抗

8、体［9］。1∶100稀释DONOVA包被液,100μL/孔,4℃冰箱过夜;弃去包被液,每孔注入200μL洗液,于振荡器上振荡3min,如此重复洗涤3次;拍干酶标板,每孔加入150μL溶液封闭酶标板,37℃封闭2h;洗涤3次,按100μL/孔加入抗