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1、抗呕吐毒素多克隆抗体的制备、纯化及鉴定作者：张银志，王俊双，孙秀兰【摘要】耳的：制备呕吐毒素(DON)的多克隆抗体，并对抗体效价、特异性和抑制率进行鉴定。方法：采用EDC法合成了呕吐毒素的完全抗原DONBSA,并通过免疫新西兰大白兔，得到呕吐毒素的多克隆抗体。结果：ELTSA检测出多抗中含有呕吐毒素的特异性抗体，其效价最高为12800,其抑制率为50%时，DON的浓度为10mg/L,DON的最低检测浓度为0.1mg/Lo与结构类似物T2毒素和NIV的交叉率分别为9.1%和4.9%。结论：呕吐毒素经过衍生化后制备出完全抗
2、原，经免疫新西兰大白兔后得到的多克隆抗体可以完全满足EHSA检测的需要。【关键词】呕吐毒索；多克隆抗体；鉴定呕吐毒素(vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(dcoxynivalcnol;DON))[1],化学名为3a,7a,15一三瓮基草镰抱菌9烯8酮，属单端抱霉烯族化合物。DON主要由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和黄色镰刀菌(Fusariumculmorum・)产生，广泛存在于霉变的小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，具有急性毒性、免疫毒性和胚胎毒性等危害[2-4]。目前国内关于DON的检测方
3、法，主要包括薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法（GC）、LCAPCIMS和免疫学检测方法。免疫学检测方法具有特异性强、灵敏度高、实验操作较简单等优点，广泛应用真菌毒素检测。冃前国内有少数几家公司生产用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒，但生产屮的主要试剂DON的完全抗原和多克隆抗体基本来自于国外，价格昂贵。我们在本实验室合成了DON免疫抗原和检测抗原的基础上，制备了DON多克隆抗体，对抗体效价和特异性进行检测,研究结果为建立呕吐毒素的免疫检测方法奠定了基础。1材料和方法1.1材料酶标仪、洗板机和
4、可调试移液器为ThermoLabsystem公司；冷冻离心机为Allegra公司；冷冻于燥机为Labconco公司；微量可调移液器:Finnpipette公司;96孔和16孔酶标板:Corning公司。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）Jiff弗氏不完全佐剂（TCFA）、弗氏完全佐剂（CFA）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋口（OVA）均购自于Sigma.公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（HRPIgG）、1乙基3（3二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐(EDC•HC1)U!甲基联苯胺（TMB）上海生工生物技术服务工程公司;Twe
5、en20国药集团化学试剂有限公司。透析带（截留分子量14000）为上海华美生物工程有限公。新西兰长耳白兔（雄性，1・5〜2・0kg）购自上海陈行实验用兔有限公司。1.2.1完全抗原的制备(1)分别称取DCC0.78mg>NHS1.38mg,并分别溶于100uL的DMF屮，待用。(2)分别称取4mgBSA和MBSA溶于200uL,0.01mol/LpH7.4PBS中，冰箱中冷藏待用。将DON衍生物溶于350»L的DMF中，将NHS溶液加入，并在搅拌的同时缓慢加入DCC溶液，混合物在4°C避光反应2h,经离心提取上清夜，然
6、后在搅拌的同时缓慢滴加BSA(或MBSA)溶液，4°C下缓慢搅拌反应20ho(3)将产物溶液用0.01mol/LpH7.4PBS溶液在4°C下透析72h,每12h换透析液1次，溶液用小瓶分装，真空冷冻干燥后，在4°C保存。制备包被抗原所用的蛋口为OVA,方法与免疫抗原相同[5-8]o1.2.2抗血清的制备选3只健康新西兰雄性大白兔，取其中1只作为阴性对照，剩余2只为实验组。初次免疫时，将DONBSA冻干粉用生理盐水溶解，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量，配成1g/L的溶液。将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅
7、拌法将其充分乳化好后，于实验动物背部皮下多点注射，ImL/只。初次免疫后的免疫称为加强免疫，加强免疫用福氏不完全佐剂乳化，第1次加强免疫于足下注射，以后的加强免疫于肌肉多点注射，每2周加强免疫1次，剂量与初次免疫相同。第2次加强免疫后，每隔2周耳缘静脉取血测定效价变化，4次加强免疫后从耳缘静脉采血，采用间接酶联免疫法测定抗血清效价。待效价达到要求后，单独用免疫原冲击免疫1次，7d后采用颈动脉取血获得抗血清，收集于50mL灭菌塑料离心管中，备用。1.2.3纯化塑料离心管倾斜，与水平成50°于室温下静置4h,待血液凝固后，
8、于4°C冰箱过復，血清自然析出。将血清吸出后,3000r/min离心15min,取上清，与前面吸出的血清混在一起，再以4000r/min离心10min,然后加入0.2g/L叠氮钠和500mL/L廿油，分装，-20£保存备用。1.2.4效价测定采用饱和硫酸钱二次沉淀法纯化抗体[9]o1:100稀释DONOVA包被液，100uL/孔，
