tpx2基因用于宫颈癌诊断与治疗的实验研究

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1、前言宫颈癌是全球女性高发的恶性肿瘤之一，其发生率仅次于乳腺癌，是最常见的妇科恶性肿瘤。随着我国居民生活水平和饮食习惯的变化，近年来宫颈癌的发病愈来愈呈现年轻化的趋势。虽然人乳头瘤状病毒（Humanpapillomavirus，HPV）疫苗和宫颈细胞学筛查的应用使宫颈癌及癌前病变得以早期预防、诊断和治疗，但是由于早期宫颈癌通常无明显症状和体征，部分患者因宫颈外观正常而漏诊、误诊，导致发现时手术切除较困难，同时辅助的放疗和化疗效果因个人体质不同而存在一定差异。因此，寻求一种早期诊断和高效治疗宫颈癌的方法成为当前妇科恶性肿瘤亟待解决的重要问题之一。宫

2、颈癌的发病机制是多因素相互作用和共同参与的复杂过程，其主要环节是由于高危型HPV感染，导致相关癌基因的激活、抑癌基因的失活和机体免疫调节机制失衡等一系列病理变化，进而引起细胞增殖、细胞凋亡调节的异常改变，最终引起癌变的发生。由于多种基因的相互作用导致宫颈癌的发生和发展，故深入探讨并研究相关基因的功能和其诱导细胞增殖或凋亡的机理，阐明其介导的细胞信号转导通路对宫颈癌的诊断和治疗具有重要意义。TPX2于十余年前被科学家发现，又称靶向XKlP2靶蛋白（TargetingProteinforXenopusKinesin-likeProtein2，TPX

3、2）。研究结果表明TPX2基因与肺鳞状细胞癌、口腔鳞癌、乳腺癌等恶性肿瘤的发生、发展有密切的关系。TPX2是一种严格受细胞周期调控的微管相关蛋白，恶性肿瘤中过表达的TPX2可导致细胞中心体异常扩增和细胞恶性转化，与恶性肿瘤的发生和发展明显相关，故阻断TPX2基因的表达有望成为恶性肿瘤的候选治疗靶点之一。恶性肿瘤的发生、发展是多因素、多基因相互作用的网络式调控的结果，通常单一性的针对某外源性基因或内源性基因的治疗效果不十分理想。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术不仅对于内源性基因和外源性基因具有明显的作用效果，还可以针对细

4、胞信号通路的多基因共同序列同时抑制多基因的表达。应用RNAi可以靶向作用于细胞内的多种基因，有利于进一步分析与癌症发病可能存在相关性的各种基因特征，阐明肿瘤细胞增殖和死亡的分子机制，深入了解恶性肿瘤发生、发展、转移的机制揭示肿瘤细胞的信号转导通路，从而为肿瘤的靶向诊断和基因治疗提供新的标记物和靶I点。综上所述，本课题拟对TPX2基因在不同宫颈组织中的表达情况及其与患者临床分期、淋巴转移和病理分化程度的相关性进行研究，应用RNAi靶向沉默TPX2基因，随后观察其诱导宫颈鳞癌细胞SiHa和宫颈腺癌细胞HeLa的细胞凋亡情况和生物学行为改变，进一步探

5、讨高危型HPV感染后TPX2可能介导的细胞信号转导通路和作用机制。旨在为宫颈癌的早期基因诊断和基因治疗提供新的研究靶点，同时为RNAi在妇科恶性肿瘤的早期临床诊断和个体化治疗研究奠定实验基础。II中文摘要TPX2基因用于宫颈癌诊断与治疗的实验研究目的：本课题拟设三个部分进行实验研究。第一部分从细胞水平和组织水平明确TPX2在宫颈不同生理或病理状态下表达的差异性，了解从正常宫颈上皮到CIN再到宫颈浸润癌组织中的TPX2蛋白的表达水平，并结合病例分析，探讨其与宫颈癌的临床分期、病理分化程度和淋巴转移的关系。第二部分探讨小干扰RNA靶向沉默TPX2基

6、因对宫颈鳞癌SiHa细胞的生物学行为影响。第三部分基于RNAi构建稳转染HeLa细胞株，探讨RNAi抑制TPX2蛋白表达对细胞生物学行为的影响和激活p53、p21、Rb细胞信号转导通路的可能性。方法：选取HPV阳性型的人源宫颈鳞癌SiHa细胞株、宫颈腺癌HeLa细胞株和经医学伦理委员会审查同意后且经病理切片诊断证实的97例不同宫颈组织标本作为实验研究材料。第一部分实验采用Western-Blot免疫印迹分析、RT-PCR和免疫组化研究宫颈不同生理或病理状态下TPX2的表达情况。第二部分实验利用RNAi对SiHa细胞中的TPX2基因进行特异性抑制

7、，通过流式细胞术、MTT和侵袭试验检测TPX2抑制后对细胞生物学行为的影响。第三部分构建重组担载TPX2-shRNA的真核载体质粒，并转染HeLa细胞，构建稳转染HeLa细胞株，采用Q-PCR、Western-Blot免疫印迹分析法、MTT、流式细胞术、TUNEL法观察TPX2-shRNA对HeLa细胞的生物学行为的影响以及E6、TPX2、p53、p21、Rb之间的可能相互作用机理，探讨高危型HPV感染后E6、TPX2激活p53、p21、Rb细胞信号和介导细胞信号转导的可能性。结果：第一部分实验结果为TPX2蛋白和TPX2mRNA在CIN、宫颈

8、鳞癌组织、宫颈腺癌组织、宫颈鳞癌细胞SiHa和宫颈腺癌细胞HeLa均有不同程度的表达，但是在正常宫颈上皮组织内，TPX2几乎不表达；随着病情发展，从C