【基因诊断与治疗】基因诊断的发展历程

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1、第二章基因诊断的发展历程基因诊断的发展历程基因诊断技术的发展，经历了间接基因诊断、宜接基因诊断、动态基因诊断三个主要阶段。1间接基因诊断间接基因诊断是利用遗传标志，推测某一疾病基因的存在与否，从而辅助疾病诊断。遗传标志经历了三代发展，简述如下：第一代多态性标志：限制性片段长度多态性（RFLP）restrictionfragmentlengthpolymorphisms该技术ihGrodzicker等于1974年创立。特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产牛分子暈不同的同源等位片段，或称限

2、制性等位片段。RFLP标记技术的基木原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除解切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的氏度发牛变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLPo第二代多态性标志：1985年Jeffreys发现重复序列及其多态性VNTR(variablenumberoftandemrepeat)可变数串联重复序列(VariableNumberofTandemRepeat,VNTR)通常由二个核口■酸组成的单元如”胞唏

3、噪+腺瞟啾”(CA)经过若干次重复组成,山于重复的次数(即n值)是可变的,因而构成一种多态类型•在非严格定义的情况卜•，也称为微卫星重复多态，然而VNTR是从多态自身的结构特点来命名的,而微卫星重复多态是从此类DNA在梯度离心分离时所表现的特性提岀来的.VNTR是近年提,*II的概念，因其在基因组屮分布极为丰富，故应用日趋广泛.就某-VNTR而言,通常重复单元可以表现出几次到几十次不同的重复,并由此决定不同的长度类塑，因而其蕴含的多态信息量(PIC)较人.STR(shorttandemrepeat)人类基因组D

4、NA有3x109bp,其中10%是串联IE复序列，称为一卫杲DNAo按重复单位的长短，乂可分为人卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中重复单位仅由2-6bases组成的叫微卫星(microsatelliteanalysis),又称它为短串联重复序列(ShortTandemRepeat.STR),STR是存在丁人类基因组DNA中的一类具有长度多态性的DNA序列，不同数目的核心序列呈出联重复排列，而呈现岀长度多态性，通常多态性片段长度在100-300bpo一般认为，人类基因组DNA中平均每6〜10kb就有一个STR位点

5、，其多态性成为法医物证检验个人识别和亲子鉴定的丰富來源。不同人体基因组卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此，形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。第三代多态性标，忐：单核诗酸多态性SNP(singlenucleotidepolymorphism)单核背酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核tr酸的变界所引起的DNA序列多态性。1.1第一代多态性标志基本步骤：DNA提取一用DNA限制性内切酶消化―凝胶电泳分离限制性片段-将这些片段按原來的顺序和位置转移到易操作的滤膜上-用放射性同位素或非放射性物质标

6、记的DNA作探针与膜上的DNA杂交(称Southern杂交)-放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酚切片段多态性。例：EcoRI酶切示意图5，AG-—GAATTC—GAATTC—-GAATTC—CG3，3，TC-—CTTAAG—CIIAAG—CTTAAG…GC5’AG-—GAATTC—GAATTC—-GAATTC—CGTC-—CTTAAG—CTTAAG・—CTTAAG—GC5，AG-—GAATTC—GAATCC—-GAATTC—CG3’3，TC■…CTTAAG…CTTAGG——CTTAAG—GC

7、5'AG…・GAATTC…GAATCC…・GAATTC-CGTC--CTTAAG--CTTAGG-—CTTAAG--CGRFLP标记的主要特点：（1）遍布于整个基因组，数量儿乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子;（4）结果稳定、可靠;（5）DNA需要呈大，检测技术繁杂，难以用丁•人规模的育种实践中。限制性片段长度多态（RFLP”〉析在人群中，不同个体之间，其DNA碱基序列存在着DNA多态性。据估计，大约每100〜200个碱基中就有一个发生中性替代而出现多

8、态性。尽管这种多态性并不引起疾病，但却可影响到限制嗨的切点改变。由于RFLP呈孟徳尔式遗传，因此可用为染色体上疾病基因座位的遗传标记，通过RFLP的连锁分析,对疾病进行间接诊断，来推测一个家庭成员和胎儿是否携帯有遗传病。我国在20世纪80年代中期已应用这一技术成功地进行了P地屮海贫血病、苯丙酮尿症等遗传病的基因诊断。RFLP连锁分析是一种十分有用的遗传病诊断技术，适用于诊断任何一种单基