tpx2基因对宫颈癌生物学作用的实验研究

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1、河北医科大学博士学位论文TPX2基因对宫颈癌生物学作用的实验研究姓名：常海平申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：程建新201204中文摘要TPX2基因对宫颈癌生物学作用的实验研究摘要目的：TPX2(targetingproteinforXenopuskinesin．1ikeprotein2是一个受细胞周期严格调控并在细胞有丝分裂纺锤体形成过程中发挥重要作用的微管相关蛋白。有研究者发现其在某些恶性肿瘤中存在高表达，导致细胞中心体异常扩增、异倍体形成及细胞恶性转化，进而促进细胞增殖，影响周期和凋亡，并与肿瘤分化、转移和复发明显相关。阻断其表达可抑制止肿瘤细胞

2、生长，有望成为肿瘤治疗的候选靶点。宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展和转归与多种因素有关。TPX2是否参与其中，目前国内外尚未见报道。本课题研究了TPX2在宫颈癌的表达及在体内外沉默后对宫颈癌细胞增殖、侵袭的影响，旨在为宫颈癌诊治开拓新的靶点。方法：本课题分总共分四部分，第一部分借助RT-PCR及免疫组化技术对宫颈癌组织、鳞癌siha细胞及腺癌hela细胞中的TPX2在的表达进行研究，并结合临床病理资料进行分析，以探讨TPX2在子宫颈癌中的表达情况及其与子宫颈癌患者临床分期、淋巴结转移及组织病理分化程度的关系，为宫颈癌的诊治提供新的依据。第二部分研

3、究了在宫颈鳞癌siha细胞沉默TPX2基因后其生物学行为的变化。在体外合成TPX2特异性的si砌蛆四对，siRNA阴性对照一对。Lipofectamine2000介导siRNA转染siha细胞株。荧光显微镜测其转染效率。本实验所有检测项目都按如下分组：实验中以PBS代替转染剂和siRNA混合物设置为空白对照组，转染阴性siRNA为阴性对照组，转染TP勉．siRNA者为实验组。RT-PCR检测转染前后mRNA表达的变化，并选择出最有效fl勺siRNA做后续实验。Westernblot检测转染前后蛋白表达的变化。MTT法检验TPX2．siRNA对siha细胞增殖

4、活性的改变：每组设3个平行孔，将各组细胞分别接种至96孔板培养24小时，按照操作步骤进行转染，分别于转染后Od,时、24d'时、48d'时、72d'时、96d,时，用酶联仪于570nm处检测各孔吸光度值，并据此绘制细胞生长曲线。流式细胞仪检测TPX2沉默后siha细胞的周期和凋亡的变化。Transwell体外侵袭实验测定TPX2沉默后siha细胞侵袭能力的改变：将各组细胞滴]Jl-于Matrigel包被的含有微孔滤膜的Transwell小室，培养24小时，95％乙醇固定，结晶紫染色，显微镜下计数各组穿膜细胞数。第三部分研究了TPX2．siRNA对人宫颈腺癌h

5、ela细胞体外生长的影响，方法同第二部分。为了中文摘要进一步验证TPX2特异性I约siRNA在体内对宫颈癌细胞生长的影响。第四部分研究了TPX2．siRNA对裸鼠皮下HeLa细胞移植瘤生长的影响。实验所用siRNA经2’Ome修饰，与lip02000孵育后转染Hela细胞及瘤体内注射。实验裸鼠分组：TPX2．siRNA转染组(接种转染TPX2．siRNA的hela细胞成瘤)，siRNA阴性对照组(接种转染阴性siRNA的hela细胞成瘤)，TPX2．siRNA治疗组(接种hela细胞成瘤后，TPX2．siRNA瘤内定期注射治疗)，空白对照组(接种hela细胞

6、成瘤后，生理盐水瘤内定期注射治疗)。通过观察各组裸鼠皮下移植瘤的成瘤时间、绘制移植瘤体积生长曲线，移植瘤体积和重量的对比、RT-PCR、免疫组织化学法来研究TPX2．siRNA对TP)(2基因的沉默效应及TPX2．siRNA对HeLa细胞裸鼠移植瘤的抑制效果。结果：第一部分①经RT-PCR检测，正常宫颈组织中TPX2mRNA的相对表达量为0．080+0．030，宫颈腺癌组织中TPX2mRNA表达为0．4674-0．031，宫颈鳞癌组织中相对含量为0．441±O．011，HeLa细胞的表达为1．923±O．040，Siha细胞的表达为1．679±0．042，各

7、组与正常宫颈组织比较均有统计学差异(P

8、在有淋巴结转移组的表达强于无淋巴结转移组(P(0．0