淀粉样β-蛋白神经毒作用烟碱受体机制：电生理和细胞内钙成像的研究

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1、山西医科大学博士学位论文淀粉样p．蛋白神经毒作用的烟碱受体机制：电生理和细胞内钙成像研究论文摘要阿尔茨海默病(Alzheimer’SDisease，AD)即老年性痴呆，是一种发生在中枢神经系统中以认知、学习和记忆功能障碍为特征的原发性神经退行性疾病。AD的典型病理特征之一是脑内出现高密度的老年斑，老年斑的主要成份是由39--43个氨基酸组成的淀粉样D·蛋白(Amyloidp-protein,A13)。目前，关于全长的Ap分子如AlBl．40或Apl42的神经毒性作用，无论是离体还是在体实验，都已有广泛报道。人工合成的一个短的A15片段，A1325-35，也被许

2、多研究发现具有同全长Ap分子相同的神经毒性作用。我们实验室先前的实验表明，A1331-35，一个比AB25．35更短的片段，也具有致大脑皮层细胞凋亡和伤害有关离子通道的作用。这些不同片段对神经细胞生存的效应提示，AB的神经毒性作用可能集中在其分子结构中的某些关键氨基酸序列之中。AD的另一个典型的病理特征是，基底前脑胆碱能神经元发生退行性变和继发的大脑皮层及海马胆碱能系统功能障碍。胆碱能受体包括毒草碱型和烟碱型两大类。有报道表明，相对于毒蕈碱型受体或其它受体而言，AD病人脑内更多的是烟碱受体水平的明显下降。烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinicacetylcho

3、linereceptors，nAChRs)是一组多基因家族的配体门控离子通道，它参与脑内包括认知活动在内的多种功能调节。研究发现，ABl42在pmol和nmol的浓度范围内分别对叮和o．4132亚型烟碱受体具有高亲和力。因此，表达有a7和04[32nAChRs的神经元可能尤其脆弱，更容易受到A13的伤害。海马长时程增强(10ng．termpotentiation,LTP)是由强直刺激作用于海马兴奋性突触的突触前传入通路后，在突触后神经元表现出的长时间突触传递效率增强的现象。作为突触传递可塑性的表现形式，海马LTP己被广泛作为研究学习和记忆的细胞模型。已有研究发

4、现，全长的Ap分子如Apl42及其活性片段Ap25-35能够压抑大鼠在体海马或离体海马脑片由高频刺激诱发的u．P。然而，A瞰1．35片段是否也具有与Apl42或Ap25-35一样的生物活性以及AB压抑LTP的机制仍然不清楚。尤其是，在A13引起的L1甲压抑中，nAChRs是否发挥作用和如何发挥作用仍然是一个有争议的问题。虽然曾有报道，nAChRs激动剂可以诱导海马LTP，并且吸烟和AD呈负相关；但最近的研究发现，nAChR．s亚型激动剂也可2山西医科大学博士学位论文以在大鼠海马齿状回直接压抑LTP的诱导，并且有调查表明，相对于不吸烟者，吸烟者有更高的发生AD的

5、危险性。另一方面，在海马脑片和培养的大鼠海马神经元上已经记录到不同类型的烟碱电流，这为研究AD时胆碱能系统功能活动的改变创造了条件。这些神经元上的nAChRs可以影响和调节突触传递的可塑性，其功能活动的改变至少可以部分地用以解释烟碱受体对学习和记忆的影响。但至今还没有在急性分离的海马神经元上看到有关nAChRs分布的报道，即使在其它方式获取的标本上，A13对nAChRs及其介导的电流的调制作用也仍有争议。同时，大量研究已经证明，钙离子(ca2+)作为一种第二信使在调节细胞反应、影响神经系统的发育和突触可塑性活动中起关键作用。并且，细胞内Ca2+稳态的破坏程度，

6、与某些神经退行性疾病的发生以及病理损伤程度密切相关。目前已经肯定，AD时由AB诱导的细胞内ca2+浓度(intracellularcalciumconcentration,【cali)的异常增高即钙超载是AB发挥神经毒性作用的重要机制之一。然而，Ap引起细胞内钙超载的机制还不完全清楚。鉴于神经元nAChRs对AB具有高的亲和力以及nAChRs本身对ca2+有相对高的通透性，探讨nAChRs是否介导了Ap引起的【c竹i升高，显然也是一个值得研究的问题。因此，在本研究中，我们进行了如下工作：(1)利用场电位记录手段，研究了三种不同的Ap片段(Ap25-35、A[3

7、3l-35和Ap35-31)对在体海马LTP诱导的作用以及可能的nACbRs机制；(2)采用全细胞膜片钳技术观察了nAChRs是否在急性分离的海马CAI神经元上有功能性的表达，以及AB对nAChRs电流的调制作用；(3)使用荧光Ca2+成像技术研究了AI；引起【ca2+】i，增加的nACb_Rs机制。除此之外，本研究在所有实验中，都观察了三种不同的AB片段的作用，通过对三者作用的比较，试图证实我们先前提出的假说，即A[331-35可能是全长AB分子发挥神经毒性作用的更短的活性中心。第一部分：淀粉样p．蛋白对大鼠在体海马CAl区LTP的压抑作用及其nAChRs机

8、制研究为研究不同的AB片段对大鼠在体海