硫胺素缺乏对β-淀粉样多肽前体蛋白加工和aβ生成的作用及机制研究

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1、复旦大学博士学位论文硫胺素缺乏对β－淀粉样多肽前体蛋白加工和Aβ生成的作用及机制研究姓名：张骑鹏申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：孙安阳20080930中文摘要一、中文摘要硫胺素缺乏对13-淀粉样多肽前体蛋白加工的调节阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)是老年痴呆的最常见类型，其神经病理学特征主要表现为沉积在细胞外的老年斑(Senileplaques，SPs)和细胞内聚集的神经纤维缠结(Neurofibrillarytangles，NFTs)以及区域性的神经元丧失。目前，对于AD的发病原因及其病理机制了解甚少，尚没有有效的治疗方

2、法。p淀粉样多肽(13-Amyloidpeptide，Ap)是SPs的主要成分，来源于p淀粉样多肽前体蛋白(Amyloidprecursorprotein，APP)的蛋白剪切。大量研究表明A13的代谢异常可能是AD起始性的病理环节。研究AB的代谢对于探讨AD的发病机理较为重要。硫胺素(Thiamine)即维生素Bl，是人体必需的营养成分。硫胺素在体内主要以焦磷酸硫胺素(Thiaminepyrophosphate，TPP)的形式存在，TPP是糖代谢途径中的丙酮酸脱氢酶复合体，a．酮戊二酸脱氢酶复合体以及磷酸戊糖途径中的转酮醇的辅酶因子。硫胺素在维持脑内氧化代

3、谢平衡方面也发挥了重要作用。硫胺素缺乏(Thiaminedeficiency，TD)会导致以上三种酶类的活性下降、三羧酸循环发生障碍、三磷酸腺苷(adenosine．triphosphate，ATP)产生受阻。此外，硫胺素缺乏过程中产生了大量的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)，导致了氧化应激的发生。主要依靠糖代谢提供能量的神经组织对硫胺素缺乏高度敏感，硫胺素缺乏的中枢神经表现称为脑型维生素Bl缺乏症，也称韦尼克一科尔萨科夫综合症(Wemicke．Korsakoff'ssyndrome，WKS)，病人除了有明显的认知丧失、记忆力减

4、退外，晚期WKS病人出现脑室扩大，神经元死亡。其脑内的KGDHC活性也明显降低。在硫胺素缺乏动物模型上，硫胺素缺乏处理的小鼠脑内出现了神经元死亡，小胶质细胞、星型胶质细胞肥大、增生等神经退行性疾病的共同病理表现。此外，研究显示，在AD病人中，TPP含量和TPP依赖型的酶类的活性都有明显的下降，表明硫胺素缺乏可能在AD病理中起了一定的作用。但硫胺素缺乏在AD中的具体作用尚未得到系统的研究。我们在体外培养的稳定转染了瑞典型突变APP基因(APPsw)的人源神经母细胞瘤细胞株(SH．SY5Y)上和C57BL／6J小鼠上成功诱导了TD模型，并通过酶连免疫吸附实验、

5、免疫印迹实验、免疫组织化学等技术手段系统地研究了TD对APP加工(APPprocessing)的影响以及其可能的机制。首先，在APPswSH．SY5Y细胞上，TD处理5天导致了大约13．5％的细胞死亡，发生凋亡的细胞增加了2倍。MTT法检测表明TD处理5天导致细胞活3中文摘要力下降了大约50％。第二，酶连免疫吸附实验测定A13的结果显示：TD处理显著增加细胞外和细胞内的913的含量。与对照组(胞外的Afl40和A陆分别是5．52_+0．12和0．66±0．23pg／m1．rag)相比，TD5天组胞外的A‰和A险分别上升到18．57+2．31和3．85+0．

6、52pg／m1．mg；细胞内的A‰和A[342分别从对照组的23．4±5．17和7．06±1．03pg／mg分别上升到86．0318．19和23．52±1．02pg／mg。第三，免疫印迹实验显示在TD过程中，细胞中成熟形式的APP蛋白水平降低，不成熟形式的APP蛋白水平没有明显变化。说明在TD过程中APP的表达水平没有增加，应该不是导致AB积累的原因。第四，酶活力测定的结果表明负责APP加工的p分泌酶的活性在TD过程中明显增高，而丫．分泌酶的活性在这一过程中没有显著性变化。前人研究结果证实13-siteAPPcleavingenzymel(BACEl)具有

7、肛分泌酶的活性，我们分别从转录以及翻译水平研究了BACEI基因的表达情况，发现在TD处理过程中，BACEl基因的mRNA水平没有明显变化，BACEI的蛋白总量也没有明显改变。然而，与对照组相比，BACEl蛋白的成熟形式增加了大约2倍，而不成熟形式的BACEl降低了大约50％。表明p分泌酶的活性调节不是通过增加BACEl基因的转录水平或翻译水平，而是通过促进BACEl蛋白的翻译后修饰(BACEl蛋白的成熟过程)来实现的。为了进一步确定p分泌酶的活性在TD过程中明显增高，我们检测了TD过程中p分泌酶产物：pCterminalfragment(p．CTF)的变化

8、，免疫印迹结果显示13-CTF含量在TD过程中明显增高。第五，TD