淀粉样前体蛋白的突变在aβ形成过程中作用研究

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1、淀粉样前体蛋白的突变在Aβ形成过程中作用研究张欢欢2015年6月中图分类号：TQ028.1UDC分类号：540淀粉样前体蛋白的突变在Aβ形成过程中作用研究作者姓名张欢欢学院名称生命学院指导教师庆宏教授答辩委员会主席张经华教授申请学位工程硕士学科专业生物工程学位授予单位北京理工大学论文答辩日期2015年6月StudyonProcessingofAmyloidprecursorprotein(APP)mutationsandtheformationofamyloid-βpeptidesCandidateName：HuanhuanZhangSchoolorDepartment:Schoolof

2、LifeScienceFacultyMentor:Prof.HongQingChair,ThesisCommittee：Prof.JinghuaZhangDegreeApplied:MasterofEngineeringMajor：BioengineeringDegreeby:BeijingInstituteofTechnologyTheDateofDefence：Jun,2015研究成果声明本人郑重声明：所提交的学位论文是我本人在指导教师的指导下进行的研究工作获得的研究成果。尽我所知，文中除特别标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京理工

3、大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的任何贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。特此申明。签名：日期：北京理工大学硕士学位论文摘要阿尔茨海默症是当今威胁老年人身体健康的主要疾病之一，目前还没有很好的治疗方法和药物。Aβ是阿尔茨海默症患者脑内神经炎性老年斑的主要成分。Aβ短肽的产生是淀粉样前体蛋白（AmyloidPrecursorProtein，APP）依次被β-分泌酶和γ-分泌酶水解而形成的，据研究Aβ（1-40，1-38）和Aβ（1-42,3-40）较其他形式Aβ更具有淀粉样蛋白毒性。研究表明，APP基因突变是家族性阿尔茨海默症的

4、遗传因素之一，对APP基因突变的深入将有助于加深对阿尔茨海默症致病相关通路的认识。本课题选取5个APP单核苷酸突变类型：A673T、A673V、E682K、E693G、E693Q，采用重叠延伸PCR的方法获得5个APP突变基因，双酶切后将突变基因与pcDNA4质粒连接，构建重组真核表达质粒。以pcDNA4为对照组，分别将pcDNA4/APPWT-mycHis或pcDNA4/APP-mycHis突变质粒与pcDNA4/BACE1-mycHis瞬时转染入HEK293细胞，进行突变基因的表达。采用WesternBlot的方法检测转染APP突变质粒后APP水解切割过程相关蛋白水平，包括APP蛋白

5、、C99片段等，采用LC-MS/MS检测Aβ产生过程中生成的三肽、四肽。结果发现，与APP野生型相比,A673V、E682K、E693Q三种突变均使APP蛋白水解量增多；虽然相比于APP野生型，E682K、E693G两种突变均使C99片段的生成量提高，但A673T突变能使C99与C83片段生成量的比率明显降低。ELISA结果显示A673T组Aβ42水平明显低于APP野生型，其他4个突变组Aβ42水平均高于APP野生型；而A673T组Aβ40水平与APP野生型相比却无明显差异，其他4个突变组Aβ40水平均低于APP野生型；Aβ42/Aβ40比率显示，A673T组Aβ42/Aβ40较APP野

6、生型明显降低，而其他四个突变组Aβ42/Aβ40比率均明显高于APP野生型。LC-MS/MS质谱结果显示A673T组Aβ40和Aβ42水平均降低；A673V和E693Q两组Aβ40水平降低，Aβ42水平升高；E682K组Aβ40和Aβ42水平均升高；E693G组Aβ40水平升高，Aβ42水平降低。综合研究结果，A673T突变能通过调控毒性Aβ生成量减少，从而对阿尔茨海默症起到一定保护作用。其他4种突变均能够促进APP蛋白水解产生Aβ42，这对理解阿尔茨海默症病理发生APP机制增加了实验数据支持。关键词：阿尔茨海默症；淀粉样前体蛋白；基因突变；β-淀粉样蛋白；质谱检测I北京理工大学硕士学位

7、论文AbstractCurrently，Alzheimer'sdiseasehasbecomeahealthhazardfortheelderlyinourmajordiseases,andthereisasyetnoeffectivedurgtreatment.AmyloidβplaquesareadefiningcharacteristicofAlzheimerDisease.Aβisa38~43aminoacidpeptide