利用单灭活原生质体融合技术选育降酸能力强的葡萄酒酵母

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1、维普资讯http://www.cqvip.com第6卷第3期中国食品学报VoI．6No．32006年6月JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnologyJun．2006利用单灭活原生质体融合技术选育降酸能力强的葡萄酒酵母高玉荣·李大鹏·高年发2(黑龙江八一农垦大学大庆163319天津科技大学天津300222)摘要目的：选育既有较好的发酵性能，又有较强的降酸能力的葡萄酒酵母菌种用于葡萄酒的生产。方法：通过发酵性能好的长城葡萄酒酵母单倍体Ll3(Lys一)(赖氨酸缺陷型)的原生质体与灭活的降酸能力强的粟酒裂殖酵母168

2、5(Ino一)(肌醇缺陷型)的原生质体进行融合实验，然后通过传代稳定性、降酸鉴定及发酵实验，选育既有较好的发酵性能，又有较强的降酸能力的葡萄酒酵母茵种。结果：得到28株融合子，融合率为6．8xl0-7，最终获得了1株传代稳定的融合子G8，降酸率为30．4％。结论：利用单灭活原生质体融合技术，选育出1株发酵力强、降酸性能好葡萄酒酵母菌株。关健词灭活原生质体降酸融合文章编号1009—7848(2006)03—0106—05葡萄酒应具有适度的酸味，但过多的酸会使1材料和方法葡萄酒有酸涩感，口味粗硬，品质下降。在我国中1．1材料部及北部地区，由于成熟期多雨及平均气温低等1．1

3、．1菌种葡萄酒酵母单倍体L(Saccha—不良条件会引起葡萄原料含酸量过高【11。正常年份romycesellipsoideus)：长城葡萄酒有限公司提供，的中国长城葡萄酒有限公司生产用龙眼葡萄汁中经生孢子培养、挑取单倍体并经紫外诱变获得，遗含总酸¨一12s／L，而成品酒的国标要求不高于7传标记为赖氨酸缺陷型，本室保藏；粟酒裂殖酵母g／L，因此，降酸一直是葡萄酒工业中要解决的问1685(Saxxhixosaocharmyetspombe)：为单倍体。上题。海工业微生物研究所提供，验证为肌醇缺陷型。葡萄酒的降酸方法很多，但都有难以克服的1．1．2培养基完全培养基、再生完

4、全培养基、再缺点。目前生产中最常用的降酸方法是酒石沉淀生完全培养基软琼脂；基本培养基、再生基本培养法。这种方法需要大量的酒石酸氢钾．耗用能源基、再生基本培养基软琼脂【3】。大，生产成本高。粟酒裂殖酵母能将苹果酸分解成降酸鉴定培养基软琼脂(％)：葡萄糖2，酒精进行生物降酸，从而降低总酸，但粟酒裂殖酵(NH4)2S00．5，YNB0．67，苹果酸0．06，琼脂0．8，母繁殖和发酵速度较慢，且酿出的酒口感较差，限溴酚兰指示剂0．5mL。制了其应用[21。若能将降酸能力强的粟酒裂酵母与1．1．3试剂PBS溶液：0．2mol／L磷酸盐缓冲液发酵性能优良的葡萄酒酵母相融合，筛选出

5、既有中加入17％蔗糖：预处理液：EDTA一疏基乙醇溶液较好的发酵性能，又有较强的降酸能力的新菌种(25mL0．05mol／LEDTA和1mL0．5mol／LB一疏用于生产，则既能降低成本又不改变原生产工艺，基乙醇的混合液)；溶壁酶(Lywallzyme)：广东省微具有广阔的应用前景。本实验室与长城葡萄酒有生物研究所；蜗牛酶(Snailase)：北京百泰生化技限公司合作进行了这方面的研究。术公司；促融剂：用0．02mol／L氯化钙溶液配制的30％聚乙二醇(PEG一6000)溶液。1．2实验方法收稿日期：2004—06—26作者简介：高玉荣，女，1970年出生，副教授1．

6、2．1原生质体制备亲株葡萄酒酵母单倍体L。，、粟酒裂殖酵母1685，各取活化菌种培养。L。，菌维普资讯http://www.cqvip.com第6卷第3期利用单灭活原生质体融合技术选育降酸能力强的葡萄酒酵母107培养8～12h，1685菌培养12～14h。各取5mL菌1．2．6融合子与亲株细胞形态特征及大小的测体，离心，无菌水洗涤2次，再用无菌水适当稀释，定[41测每毫升总菌数。1．2．7融合子的复筛将变色明显的融合子接入离心，收集菌体，悬浮于5mL预处理液中3O龙眼葡萄汁中，2O℃发酵，接种量5％。测定其发℃振荡处理20min。将菌体离心收集，用2％蜗牛酵性能。酶溶

7、液5mL处理Ll，菌，用1％溶壁酶液5mL处选择发酵性能好、降酵性能好、口感好的菌株理1685菌．30℃水浴振荡酶解l～2h，随时观察传代后接入葡萄汁中发酵。发酵8d，测其发酵性原生质体形成情况。当90％以上变为原生质体后，能的稳定性．并与亲株作发酵性能比较。离心收集原生质体，悬浮于5mLPBS溶液中，用无菌水稀释，涂布于完全培养基平板，计数剩余菌2结果和讨论数。按下式计算原生质体形成率。2．1预处理对原生质体形成率和再生率的影响原生质体形成率(％)=(A—B)／A·100％酵母破壁前一般要进行预处理，以增加菌体式中：A——每毫升总菌数；B——破壁后