酵母原生质体融合及研究进展【文献综述】

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1、毕业论文文献综述食品科学与工程酵母原生质体融合及研究进展摘要：对原生质体制备、融合方法、研究进展进行比较详细的介绍。关键词：酵母菌；原生质体；融合方法；1原生质体原生质体融合也称为体细胞杂交，是“细胞工程”的一个重要内容。始于20世60年代，在遗传育种中的运用具有十分广阔的前景。分自发融合和诱导融合2类。前者是指植物组织或细胞在用酶分离原生质体过程中发生的原生质体自然融合现象；后者是指分离原生质体以后，通过加入诱导剂或利用其他方法诱导不同亲本原生质体发生融合的过程[1]。原生质体融合技术具有许多常规杂交方法无法相比的优点：由于除去了细胞壁，

2、原生质体膜容易融合，即使没有接合、转化以及转导等遗传系统的作用，也能发生基因组的融合重组；融合没有极性，发生融合的是整个胞质与细胞核，从而使遗传物质的传递更为完善；重组率高，因而容易得到杂种菌；存在着两株以上亲株同时参与融合并形成融合子的可能[2]；打破分类界限，实现种间或更远缘的基因交流[3]；它与目前使用的基因工程方法相比不需要各种高级的仪器设备和昂贵的材料，也不需要实验菌株进行详细的遗传学研究等。2原生质体制备酵母细胞外围是一层细胞壁,总厚度约为菌体直径的1/7,主要由葡萄糖、甘露聚糖、蛋白质等组成[4]。只有去除细胞壁,才能使原生质

3、体游离出来，目前去壁的方法,绝大多数采用酶解法,一般选用终浓度1%~2%的蜗牛酶。酶解液的体积按照以下方法来换算：菌丝重量的1.5倍就是酶解液的量，酶解液为混合酶液，蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶以一定的浓度混合，用渗透压稳定剂配制而成。酶液的配置要现配现用：一是为了防止酶的失活，二是防止对量的估计不足而造成浪费。酶液的配置要在无菌条件下配置防止有杂菌的进入，从而影响实验的结果。加入混合酶液后将菌丝和酶液充分混匀，放入适当的温度、转速为100r/min的摇床中酶解一定的时间。酶解完成之后将混合液用四层滤纸（已紫外灭菌）过滤，接着将滤液装入EP管（

4、已灭菌）以6000r/min离心20min。之后取少许上清液在显微镜下进行观察，如没有原生质体说明原生质体已经完全沉淀了。此时可以将上清液去除,即将酶液去除，酶液的去除要尽快，否则会使酶解过程过度，从而造成原生质体的破裂，影响原生质体的形成，然后用渗透压稳定剂悬浮原生质体。(以上步骤都要在无菌的条件下进行，防止杂菌的进入，造成污染影响实验结果。)酵母菌原生质体制备一般取对数生长期的单倍体细胞,此时细胞代谢活跃,生长率高,群体细胞的化学组成、形态及生理特征比较一致[4]。3原生质体的再生原生质体融合育种的必要条件：酶解去壁后的原生质体应具有再

5、生能力。尽管原生质体具有生物活性,但它不是正常的细胞,在普通培养基平板上不能正常的生长、繁殖,必须加入渗透压稳定剂。影响原生质体再生的因素主要有菌种本身的再生特性、原生质体的制备条件和再生条件等。尤其是原生质体制备时的酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大[5]。4原生质体融合的方法原生质体的融合方法经过改进和完善，已经比较成熟。最早是1972年Carlson等使用NaNO3法获得了郎氏烟草和粉蓝烟草的细胞杂种，这也是第1个植物细胞杂种。1973年Keller和Melchers提出采用高钙和高pH值诱导原生质体融合。1974年Kao等首次

6、提出采用PEG诱导原生质体融合，后来提出并相继完善PEG与高钙、高pH值相结合的方法（也简称PEG法）。1978年Melchers等用PEG法获得了马铃薯和番茄的属间体细胞杂种。1978年Zimmerman等首次提出了电融合的概念，1979年Senda等发明了电场诱导融合的方法。目前广泛使用的方法是PEG法、电融合法和激光诱导融合法。4.1PEG法PEG（聚乙二醇）是一种多聚化合物，溶于水，具有一系列分子量，分子式H(OHCH2-CH2)nOH，不同生物对PEG要求不同，一般以1000-6000为宜。PEG法诱导融合的可能机制是：PEG中醚

7、键带负电，和带负电荷的原生质体相遇后，由于Ca2+的作用使其形成共同的静电荷，从而促进异源原生质体的黏着和接合，经过高Ca2+高PH溶液清洗后，Ca2+和PEG都被洗掉，电荷平衡被破坏，使原生质体中的某些正负电荷连接起来，形成具有共同质膜的融合体。为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度（25%~50%），但PEG浓度过高也会因为细胞脱水而受到显著的破坏。该方法的优点：容易操作，不需要特别的仪器设备。缺点：原生质体聚团大小不易控制，PEG分子量、诱导液浓度等不容易掌握，且PEG对原生质体有一定的毒性，影响其再生，导致融合率不高。

8、原生质体融合如图1[6]4.2电融合法最早是由Zimmermann等及Senda等提出电脉冲可诱导细胞的融合。其原理是在短时间高频交流电作用下，在活细胞的内部，诱导去极化，引起细