根霉原生质体融合技术及发酵特性研究【文献综述】

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1、毕业论文文献综述生物技术根霉原生质体融合技术及发酵特性研究摘要：原生质体广泛的应用于食品、制药、农业等领域，本文简略介绍了原生质体的制备、融合、再生及筛选的过程中的方法和影响因素，以及后代中关于发酵腐乳特性方面相关研究所需方法的简介。关键词：原生质体；融合；微生物原生质体融合起源于20世纪50年代，经历了一个逐步改进和完善的过程，原生质体的融合方法：NaNO3、高钙高pH值、PEG法等，PEG法师采用聚乙二醇为融合剂的一种化学方法，使用简便、经济、可重复性。根霉是一种丝状真菌，属毛霉科，是霉菌中一种具有多

2、酶系特征的霉菌，它除了部分泌淀粉酶外，还能分泌酸性蛋白酶、酒化酶及乳酸、琥珀酸等多种有机酸和乙醇等。可以在整个发酵过程中始终边糖化边发酵连锁进行。根霉由于其内含丰富的淀粉酶、蛋白酶和其他酶类，常用在酿酒和制醋中分解淀粉及大豆加工中分解蛋白质。根霉分泌的胞外酶不仅种类多而且量大，从它的发酵上清液中可提取很多有用国内豆腐乳生产用的微生物除黑龙江克东豆乳腐使用的藤黄小球菌之外[1]，其余所用菌均为丝状真菌(如毛霉属、根霉属等)，均具备以下特点：不产毒素，符合食品安全与卫生要求；菌丝体长且粗壮有力，有利于对豆腐坯

3、的包裹以保证豆腐乳的良好外形；培养条件粗放，生长快，便于管理：有较多的酶系(如蛋白酶、肽酶、脂防酶)，而且酶活较高，特别是蛋白酶类，以利形成豆腐乳特有的质构与风味；生长适温宽，有利于常年生产。1原生质体融合技术原生质体融合技术(ProtoplastFusion)是将遗传性状不同的两个细胞融合为一个新细胞，使两亲株的整套基因相互重新组合的一种技术，是现代生化技术的一个分支。原生质体融合技术起源于20世纪50年代，自Weibull利用溶菌酶首次得到巨大芽孢杆菌的原生质体后，Eddy等利用蜗牛酶获得酵母菌原生质

4、体的报道也相继出现。随着原生质体融合技术不断的发展，相继出现了聚乙二醇(PEG)法、电诱导法、电磁融合法、激光融合法等新技术，在提高了融合率的同时，也渐渐形成了一套系统的实验体系，亦成为微生物遗传育种的新工具[2]。在众多新技术中，灭活原生质体融合是原生质体融合技术的重大发展。根据“致死损伤互补”的机理，双亲灭活的原生质体如果发生融合，将能在再生培养基上生长形成融合新株。双亲灭活原生质体融合法不但可以省去亲株细胞的遗传标记，避免重组体失去亲本的优良性状，而且可以用不含例如抗生素等抑制细胞生长的遗传标记物的

5、培养基作为融合子选择培养基，从而可提高筛选效率[3]。1.1原生质体的制备制备原生质体，是进行原生质体融合的前提和基础，不同菌种细胞壁组成各不相同，所以制备原生质体最佳条件也存在着很大差异。在制备菌种原生质体时，曾采用过机械法脱壁，但原生质体制备数量有限而且容易使原生质体受到损伤，不利于再生[4]。目前主要使用酶法脱壁，绝大多数使用溶菌酶和蜗牛酶作为工具酶[5]。由于酵母菌原生质体融合后的重组体融合子，容易发生回复突变，利用亲本菌株的单倍体细胞进行融合，能够有效地降低回复突变率，因此，酵母菌原生质体制备一

6、般取对数生长期的单倍体细胞，此时细胞代谢活跃，生长率高，群体细胞的化学组成形态及生理特征比较一致[6]。1.2原生质体的再生酶解去壁后的原生质体应具有再生能力，这是原生质体融合育种的必要条件，尽管原生质体具有生物活性。但它不是正常的细胞，在普通培养基平板上不能正常的生长、繁殖，必须加入渗透压稳定剂。影响原生质体再生的因素主要有菌种本身的再生特性﹑原生质体的制备条件和再生条件等。尤其是原生质体制备时的酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大[7]。1.3原生质体的融合原生质体融合有两种情况：一种为自发融合，

7、另一种为诱导融合。后一种通过人工诱导方法促使原生质体发生融合，其方法又可分为四种：(1)生物法是利用紫外线灭活的病毒膜片使细胞间产生凝聚和融合的方法，但考虑存在安全性及融合效率等因素，只适用于动物细胞融合；(2)化学法始于20世纪70年代，用化学融合剂促进原生质体融合，目前最常用的是聚乙二醇(PEG)法；(3)物理法始于20世纪80年代前后，采用电场、磁场、激光、超声波等物理手段使亲本的原生质体发生融合，常使用的物理法是电融合法；(4)混合法起源于物理融合法，包括细胞物理聚集电融合法、细胞化学聚集电融合法

8、、特异性电融合法等。它具有融合效率高、专一性强和对原生质体损伤小等优点，但存在方法和设备复杂等缺点[8]。1.4融合子的筛选原生质体融合后,真正的杂合二倍体是极少数的.大多数异核体会产生亲型分离子。如何有效地筛选出具有优良性状的融合子是至关重要的，检出融合子的方法有多种，我们可根据实验目的和微生物不同加以选择，将介绍以下几种常用方法：(1)利用营养缺陷型标记筛选融合子，假设两亲株的的遗传标记为营养缺陷型A+B-及A-B+则其重