根霉原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究【文献综述】

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1、毕业论文文献综述生物技术根霉原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究摘要：利用双亲热紫外灭活原生质体，获得融合菌株。通过测定透明圈直径，比较融合后代与亲本之间的酶活高低。关键词：原生质体热紫外双亲灭活透明圈1前言根霉是酿造业中的重要微生物，其生长过程中分泌的蛋白酶和谷氨酰胺酶等对酱油、豆瓣、米酒等传统发酵食品的产率和风味起着非常重要的作用。然而在生产实践中，米曲霉菌株的生长速度的快慢和其分泌蛋白酶活性的高低很难同时兼得。因此，通过灭活原生质体融合技术选育生长速度快且蛋白酶活性高的米曲霉菌株是目前研究的热点。原生质体融合是进行遗传育种研究的重要手段，也是获得菌种融合体和

2、重组体的有效方法。但是亲本菌株遗传标记的诱变筛选较费时费力，而且会带来一些不良突变。利用双亲灭活原生质体作为供体进行融合是近年来选育曲霉的重要方向。所谓“双灭活”就是将两种菌株的原生质体用不同的理化手段进行处理,相应地使其某一小部位的生理结构被损伤而失去活性,但决不是彻底杀死。灭活后的原生质体不能再生，而由损伤部位不同的原生质体相结合形成的融合子,因损伤部位互补则可以再生。本实验是利用热紫外双亲100%灭活融合，再用透明圈法测定酶活力从而观察后代酶活的高低。2原生质体制备与再生微生物细胞一般是有细胞壁的，进行该项技术的第一步就是制备原生质体。现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使

3、用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体形成的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长期或生长中后期的菌，也有的采用生长后期的这主要是由于对数生长期细菌的壁中肽聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感，但是对数生长早期的菌相对较为脆弱，受酶的过度作用会影响原生质体的再生率。彭智华等进行原生质体制备的过程中，用2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。陈海昌等证明，在一定范围内，酶作用的时间、酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关，而与再生率成反相关。林红雨等采用酶解lO分钟后补加EDTA的方法，改变酶解环境中的离子强度和渗

4、透压，可以提高原生质体形成率。costemnJ．w．等(1967)报道，在高渗Tris溶液中添加1．5％聚乙烯吡咯烷酮(PvP)等原生质体扩张剂，有助于制备原生质体，添加o．02ml／L镁离子，有利于原生质体的定据。本实验采用：纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶以7：3：1的比例酶解效果做好。3原生质体灭活3．1灭活原理紫外线对微生物营养细胞的杀灭作用主要与细胞内的核酸的光化学变化有关，其灭活的机制主要包括产生嘧啶二聚体以及DNA解螺旋。在不同的原生质体中，紫外线照射致死损伤的DNA部位有所不同，所以灭活后可以互补而融合。而热的作用可使细胞内有功能蛋白、酶蛋白变性失活。3．2最佳灭活条件的

5、确定稀释后的原生质体溶液于15W紫外光线下照射1、3、5、10、15min,然后每皿取1mL，涂布接种在高渗CM平板上，于28℃恒温培养48h后进行菌落计数；同时进行重复试验。按以下式计算灭活率：灭活率=（灭活前高渗CM平板上菌落数-灭活后高渗CM平板上菌落数）/灭活前高渗CM平板上菌落数×100%以灭活率刚好达到100％，即灭活后在再生平板上生长率为0时为最佳灭活条件。同理热灭活在60°下按照时间10、15、20、25、30来确定最佳灭活时间。4双亲灭活原生质体融合物理法：用物理的手段(如电场、激光、超声波、磁声等)使亲本的原生质体发生融合。最常用的主要有电处理融合法、激光诱导

6、融合法以及在电融合技术上改进的方法等。优点：电融合条件可控，融合率高，无毒。缺点：设备条件要求高，费用较高。生物法：紫外灭活的病毒膜片能使细胞间产生凝聚和融合。病毒制备困难，操作复杂，试验重复性差，融合率很低，适用于动物细胞融合。化学法：用化学融合剂促进原生质体融合。化学试剂中最常用的是PEG结合高Ca2+、pH诱导法。优点：不需要特别的仪器设备，操作简便。缺点：原生质体聚集成团的大小不易控制，且PEG本身对原生质体具有一定的毒性，可能影响原生质体的再生，另外融合率不高。本实此次采用PEG，研究表明，时间过长或PEG浓度过高都将因PEG对原生质体的毒性而使融合率降低。时间过短,原

7、生质体虽融合但不稳定,而PEG浓度低则其提供的渗透压也低,不利于融合,因此相应的融合率较低。5融合子筛选接种到综合马铃薯培养基上进行培养得融合菌株。制备各融合菌株的孢子悬液，稀释到合适浓度接种至酪素平板上，28℃培养72h，测定其透明圈直径与菌落直径的比值(Hc)，以Hc值比较蛋白酶活力的高低。6蛋白酶水解酪蛋白透明圈初筛在蛋白酶菌种选育过程中,对其产酶性能的测定,是采用福林folin法测定蛋白酶活力,即利用蛋白酶分解酪素,生成含酚基氨基酸的呈色反应来表示蛋白酶的活力。采用福林法