根霉与米曲霉原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物工程根霉与米曲霉原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究1.课题研究意义及国内外研究现状米曲霉菌落生长快，10d直径达5～6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在

2、蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。米曲霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病提供了线索。除了细菌以外，根霉是迄今为止丝状菌中产L乳酸的另一重要菌种。根霉菌是真核生物,其核有核膜包围

3、,具各种细胞器.基因结构中编码区不连续有内含子，根霉菌分布广，约10种以上。通常对人无害，食用甜酒药及糖化饲料就是选用此菌制备的。根霉菌为条件致病菌。可引起食品霉变，可导致实验室污染。致开门见山的有匍枝根霉、小孢根霉、少根根霉和米根霉等。可引起毛霉菌病，蜂窝组织炎等。根霉、米曲霉原生质体双亲融合后代第1-7代各后代的菌落、菌体形态特征的观察、分析，通过对各后代蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力、SDS电泳等多种方法测定、分析，同亲本相比较，得出融合后代的形态特征、生理生化特性和稳定性等遗传特性和变化规律。对两种霉的原生质体融合后代进行进一步的研究，

4、经人工培养多代后进行杂交试验，观察菌株的形态特征、部分生理生化形态分析以及的分析，为得到品种更优秀的，有利遗传更稳定的，作用范围更广的后代作铺垫。2.课题研究的主要内容、预期目标和研究方案主要内容：1.菌体培养基的制备、灭菌，亲本菌种的杂交。2.杂交代多个后代菌株进行形态特征分析。3.杂交代后代1、3、5、7蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力、SDS电泳。预期目标1.获得米曲霉、根霉融合后代菌株进行形态生理生化分析，了解后代遗传形态2.获得米曲霉、根霉融合后代菌株进行蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力、SDS电泳，得出数据于各个菌株进行比较。研究方

5、案：1菌种的活化与扩大培养：YPD培养基活化菌种，PDA培养基扩大菌种。1.1将准备好的菌种在无菌室超净工作台上接种于马铃薯固体培养基上，浇制2到3个。将接种好的培养基倒置于30℃恒温培养箱中黑暗培养3—5天。2菌落形态特征的观察2.1观察平板培养基上菌落蔓延状况、疏松程度，表面湿润或干燥，有无光泽，隆起形状,边缘的整齐度、大小、颜色等。3菌体形态特征的观察3.1显微镜观察菌种的形状及出芽方式。4蛋白酶活力测定4.1在超净工作台上用接种针挑取每个菌落接种到PDA培养基上分离纯化，每个培养基放3-5个，25℃培养24h。将分离后的菌落，用直径2mm的

6、吸管戳4个小区域。每个菌落用接种针挑3个接种到酪蛋白培养基上，25℃培养24h，48h分别观察透明圈大小，并计算蛋白酶活力。5淀粉酶活力测定5.1在超净工作台上用接种针挑取每个菌落接种到PDA培养基上分离纯化，每个培养基放3-5个，25℃培养24h。将分离后的菌落，用直径2mm的吸管戳4个小区域。每个菌落用接种针挑3个接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，25℃培养24h，48h后滴加卢戈氏碘液分别观察透明圈大小，并计算淀粉酶活力。卢戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定

7、容。6SDS电泳：通过SDS电泳测定蛋白质种类和蛋白质分子量。6.1制胶板的安装（短玻璃面朝内），要求密封，以免胶液泄漏。配制适量（如7.5ml）的一定浓度的分离胶，将配制好的分离胶加入制胶槽中，注意应随着边缘缓慢加入，千万别进气泡。凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿0.5cm处。轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水封胶，使凝胶表面变得平整，静放30min～1小时，使凝胶聚合。除去上面的水层，再用滤纸吸尽残留的液体。配制5%的浓缩胶（3ml）迅速将配制好的浓缩胶添加到分离胶表面，并将梳子插入凝胶内，至梳子齿的底部与前玻璃板的顶部平齐，小心避

8、免混入气泡。将凝胶垂直放置于室温下，约30min凝胶聚合。凝胶聚合后，即可进行电泳。电泳、染色和脱色。3.课题进度计划20