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《根霉原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究【开题报告】》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、毕业论文开题报告生物技术根霉原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究1.课题研究意义及国内外研究现状根霉在自然界分布很广，用途广泛，其淀粉酶活性很强，是酿造工业中常用糖化菌。我国最早利用根霉糖化淀粉（即阿明诺法）生产酒精。根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸，还能产生芳香性的酯类物质。根霉亦是转化甾族化合物的重要菌类。与生物技术关系密切的根霉主要有黑根霉、华根霉和米根霉。小曲酿酒在我国已有悠久的历史,其中起主要作用的是根霉,通常所说的霉菌糖化法制酒精也是用的根霉,日本人也曾有在酒精工业中应
2、用曲霉和根霉混合的方法。近年来很多人对利用根霉淀粉酶制造葡萄糖很威兴趣,开展了很多的研究,日本和美国在酶法由淀粉生产葡萄糖方面有一些专利,并且有商品出售的淀粉酶制剂。现在我国生产的葡萄糖,都是用酸水解法,酸法需要耐酸、耐压的设备,而且所得糖化液中葡萄糖纯度不高,合寡糖较多,当葡萄糖浓度高时,又会分解成有色的经甲基糠醛和复合成龙胆二糖,其味甚苦,影响葡萄糖的质量。若用酶糖化法制葡萄糖,不需耐酸、耐压设备,无苦味,带色生成物少,能应用高浓度的淀粉,葡萄糖纯度大,得率高。铃木繁男指出,酶水解法制葡萄糖是
3、降低成本、提高质量的有效方法.在我国,酶法制葡萄糖若能投入生产,葡萄糖工业一定会得到迅速发展。所以选择淀粉葡萄糖苷酶强的菌种,供葡萄糖生产或为发酵工业制备原料也是本研究的目的之一。根霉曲富含糖化酶、液化酶、果胶酶、蛋白酶、酒化酶,同一菌株不同的培养方法,所得酶系差异很大。根霉曲的安全性较好,用根霉曲制作的醛糟和固体饮料供人们食用时,没有发现不良反应和毒副作用。当然根霉属的菌种很多,是否每一株菌种都没有毒副作用还有待进一步研究。根霉曲作为饲用酶制剂,酶系齐全,酶作用条件温度低,适宜畜禽消化道生理条件
4、,蛋氨酸含量高,菌株抗热性能强。但在畜禽饲料中的应用时间较短,建议多做根霉曲添加剂的研究工作,以提高产品质量和应用效果。根霉原生质体双亲灭活融合后代第1-7代各后代的菌落、菌体形态特征的观察、分析，通过对各后代蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力、SDS电泳等多种方法测定、分析，同亲本相比较，得出融合后代的形态特征、生理生化特性和稳定性等遗传特性和变化规律。2.课题研究的主要内容、预期目标和研究方案主要内容：1．根霉的原生质体制备2．热紫外双亲灭活根霉原生质体融合，筛选高蛋白酶活力、高淀粉酶活力、高
5、糖化酶活力的三种融合后代。3．三种融合后代菌株以及亲本进行形态特征分析、观察。4．三种高酶力融合后代1、3、5、7分别测定蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力、SDS电泳。2.2预期目标1．制备原生质体，灭活双亲后代融合，获得三种高酶力菌种2．对三种菌株进行形态生理生化分析，了解后代遗传形态3．对三种菌株进行蛋白酶活力、淀粉酶活力、糖化酶活力、SDS电泳，得出数据于各个菌株进行比较。研究方案：1菌种活化：在无菌条件下，在PDA平板上活化，于30℃恒温培养箱内，培养5天2菌丝体培养：在无菌室内，将活化
6、好的菌株接种入已灭菌的液体培养基内，之后放入30℃，转速为120rad/min的摇床内培养16-18h。3原生质体制备：3．1将培养好的菌丝体培养液用四层擦镜纸过滤，取纱布上层菌丝，以1400转每分钟的低转速离心10min，将沉淀移入另一个已经称量过的灭过菌的离心管内，封好进行称量（这些操作都要在无菌的条件进行）。3．2酶解液的体积按照以下方法来换算：菌丝重量的1.5倍就是酶解液的量，酶解液为混合酶液，蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶以一定的浓度混合，用渗透压稳定剂配制而成。（同样也要在无菌条件下）。3．
7、3加入混合酶液后将菌丝和酶液充分混匀，放入适当的温度、转速为100rad/min的摇床中酶解一定的时间。酶解完成之后将混合液用四层擦镜纸（已紫外灭菌）过滤，接着将滤液装入EP管（已灭菌）以6000转每分钟的转速离心20min，之后取少许上清液在显微镜下进行观察，如没有原生质体说明原生质体已经完全沉淀了。此时可以将上清液去除，然后用渗透压稳定剂悬浮原生质体。4双亲灭活4．1高温灭活取根霉原生质体悬液适量于无菌离心管中，置于60。C恒温水浴箱中热灭活各30.40.50.60min.取出。分析致死率。取
8、致死率80%以上的诱变时间的原生质体涂布到再生平板上,26～28℃避光培养2~3d。4．2紫外灭活用15W国产紫外线灯管,照射距离30cm,各取5ml原生质体悬浮液悬浮于无菌平皿中分别进行1.3.5.7min的照射诱变处理,分析致死率，致死率在80%以上的诱变时间的原生质体涂布到再生平板上,26～28℃避光培养2~3d。3菌种的活化与扩大培养：YPD培养基活化菌种，PDA培养基扩大菌种。1.1将准备好的菌种在无菌室超净工作台上接种于马铃薯固体培养基上，浇制2到3个。将接种好的培养基
