根霉与酵母原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物技术根霉与酵母原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究⒈课题研究目的和意义原生质体融合(protoplastfusion)：指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。其意义：打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。为细胞融合奠定基础，克服有性杂交不能进行细胞质交流的不足。利用原生质体融合可以进行异核体杂种的培育，为一次性多基因性状的改良提供了途径

2、。通过对根霉与酵母原生质体诱变后的高酶活力菌株，对根霉与酵母原生质体一次基因改组融合后代第1-7代的形态特征和生理生化特性研究，同亲本相比较，得出融合后代的形态特征、生理生化特性和稳定性等遗传特性和变化规律。得出稳定的高酶活力菌株。2.课题研究的主要内容与基本要求：主要内容：1.根霉与酵母原生质体的制备及一次基因改组2.后代第1-7代各代的菌落、菌体形态特征的观察、分析3.对各后代蛋白酶活力、淀粉酶活力、SDS电泳4.测定、分析得出数据后，同亲本相比较，得出融合后代的形态特征、生理生化特性和稳定性等

3、遗传特性和变化规律。基本要求：1根霉与酵母原生质体一次基因改组1.1根霉与酵母原生质体的制备1.11根霉及酵母菌株1.12培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：取一定量的马铃薯，洗净、去皮、切块，在电子天平上称取100g左右，与500ml的蒸馏水一起放入锅中，煮沸20分钟，用四层纱布过滤后取浸出液，加入葡萄糖10g，琼脂10g，酵母浸出汁2.5g,蛋白胨2.5g,溶解后加蒸馏水至500ml。酵母培养基：1%葡萄糖500ml蒸馏水。液体菌丝培养基：液体马铃薯培养基（PSA），用于菌丝体摇瓶发酵。配制方

4、法：取一定量的马铃薯，洗净、去皮、切块，在电子天平上称取100g左右，与500ml的蒸馏水一起放入锅中，煮沸20分钟后，用四层纱布过滤。然后取浸出液，加入蔗糖10g，溶解后用蒸馏水定容至500ml。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨15g，琼脂7.5g,淀粉1g,加蒸馏水定容到500ml。酪蛋白水解培养基：Na2HPO4•7H201.07g，KH2PO40.36g，酪蛋白10g琼脂粉15g，加蒸馏水定容到1000mL。马铃薯再生培养基：马铃薯200g洗净去皮，之后切片放入沸水中煮20min，最后

5、得到其浸出液，加4.5g琼脂（最终溶液含量为0.9%），加入葡萄糖20g以及甘露醇和无菌水配制成1L的甘露醇浓度为0.6mol/L的混合溶液。以上培养基配置都为自然pH值条件下于0.1Mpa条件下灭菌20min获得。1.13酶液制备蜗牛酶溶菌酶纤维素酶1.14渗透压稳定剂0.8mol/L氯化钠高温高压灭菌，在0.1MPa，121℃的条件下高温高压灭菌20min后备用。渗透压稳定剂必须在无菌条件下使用，每次使用完之后马上封口，尽快放入冰箱，以防杂菌的污染。1.15菌株活化在无菌环境下，将已灭菌的PDA

6、培养基倾入灭过菌的培养皿中，制成平板；待其冷却凝固后，用无菌接种针蘸取少量保藏的菌种，采用“三点法”点种于平板上，倒置于30℃恒温培养箱内，培养5天。1.16菌丝体培养在无菌室，在酒精灯火焰旁，将液体培养基分装入灭过菌的培养瓶中并标号。将活化好的菌株接种入已经灭过菌的盛有约30ml液体菌丝培养基的摇瓶中（菌丝大小不限，只要用接种针在培养基表面菌落处轻轻蘸取一下即可，每次接种后接种针均要在酒精灯火焰中灭菌并冷却才可挑取下一个菌丝）。之后放入30℃，转速为120rad/min的摇床内培养18h。1.17

7、原生质体制备将培养好的菌丝体培养液用四层擦镜纸过滤，根据离心管大小装入一定量的菌丝体到已灭菌的离心管中，以1400转每分钟的低转速离心10min。之后去除上清液。然后将沉淀移入另一个已经称量过的灭过菌的离心管内，封好进行称量。加入混合酶液后将菌丝和酶液充分混匀，放入适当的温度、转速为100rad/min的摇床中酶解一定的时间。酶解完成之后将混合液用四层擦镜纸（已紫外灭菌）过滤，接着将滤液装入EP管（已灭菌）以6000转每分钟的转速离心20min。之后取少许上清液在显微镜下进行观察，如没有原生质体说明

8、原生质体已经完全沉淀了。此时可以将上清液去除，然后用渗透压稳定剂悬浮原生质体。1.2原生质体融合（PEG融合）2传代培养菌落形态特征的观察2.1观察平板培养基上菌落蔓延状况、疏松程度，表面湿润或干燥，有无光泽，隆起形状,边缘的整齐度、大小、颜色等。3菌体形态特征的观察3.1显微镜观察菌种的形状及出芽方式，菌丝宽度及孢子和孢子囊直径。4优良融合后代菌种的筛选4.1蛋白酶活力测定4.1．1酪蛋白水解培养基透明圈法测定其蛋白酶活力4.2淀粉酶活力测定4.2．1牛肉膏蛋白胨培