抑癌基因pten抑制人气道平滑肌细胞迁移

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1、硕士学位论文抑癌基因PTEN抑制人气道平滑肌细胞的迁移硕士研究生：钟浩海指导教师：罗雅玲教授摘要研究背景及目的支气管哮喘(Bronchialasthma，asthma)是一种以气道重塑、气道炎症、气道高反应性为表现的气道慢性炎症性疾病，许多哮喘患者的气管中除有炎性细胞浸润外，还存在不同程度的气管壁结构改变，包括主要有上皮的脱落和增生、杯状细胞和腺体增生、上皮下胶原和细胞外基质沉积、平滑肌肥大和增殖、血管形成、气道软骨减少，即气道重塑(Airwayremodeling)。炎症介质及炎症细胞对气管反复损伤

2、和机体对损伤性刺激的修复性反应所形成的气管新组织结构，而气道平滑肌细胞(Airwaysmoothmusclecells，ASMCs)作为气道中数目和体积均为最大的细胞，在哮喘气道重塑中发挥重要的作用，被认为是哮喘气道重塑的关键细胞。ASMCs的收缩、增殖、肥大、分泌细胞外基质蛋白等促进气道重塑的发生发展，并进一步加重气道高反应性(AirwayHyperreactivity，AHR)。近年来国内外的大量研究发现，ASMCs也具有迁移的功能，这种迁移与动脉粥样硬化时血管平滑肌细胞(Vascularsmoo

3、thmusclecells，VSMCs)的迁移相类似，因此我们推理：哮喘时ASMCs在细胞外基质和各种细胞因子、炎症介质和生长因子的联合作用下，ASMCs向气道内膜定向移动并发生增殖，导致气道壁的增厚和狭窄，虽然目前还缺乏ASMCs向气道内膜直接迁移的证据，但有研究发现，在哮喘患者气道活检组织标本中，气道固有层内发现的肌纤维母细胞在中文摘要显微结构、形态学和位置方面都与ASMCs极其相似，提示肌纤维母细胞可能是ASMCs迁移并转化而来，ASMCs的迁移的研究是近来的热点之一，但对于ASMCs迁移的机制

4、目前还不十分清楚。第10号染色体缺失的与张力蛋白同源的磷酸酶基因(Phophataseandten_sinhomologdeletedonchromosone10，PTEN)是至今发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，对细胞的生长、增殖、分化、凋亡、迁移和血管生长等许多生物学行为有重要影响，该基因的突变、失活与多种肿瘤的发生、发展密切相关。2003年Youn．GeunKwak及同事首次报道了PTEN参与支气管哮喘气道炎症和气道高反应性的发生，PTEN蛋白的表达和活性在卵清蛋I刍(OVA)．诱导

5、的哮喘豚鼠模型中降低，而支气管内应用携带PTENeDNA的腺病毒(Ad．PTEN)转染后，哮喘鼠BAL液中IL．4、IL．5和嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)水平下调，气道炎症减轻。大量研究已经证实抑癌基因PTEN可以通过对磷脂酰肌醇．3．激酶(P13K)、细胞外信号调节激酶(ERK)及黏着斑激酶(FAK)等信号通路的抑制从而抑制肿瘤细胞、心肌和血管平滑肌等细胞的增殖、迁移，促进细胞的凋亡。而以上这些通路同时也是介导人ASMCs增殖、迁移等的主要信号传导通路，在人ASMCs中PTEN对这些通路是否也有类似

6、地影响，目前我们尚不清楚。因此，本实验主要对以下两个方面进行研究：一)构建携带野生型质粒PTEN的腺病毒载体。二)初步探讨PTEN在ASMCs迁移中的作用。材料与方法l、经患者同意，取南方医院胸外科同期做肺叶切除术患者的正常肺叶、段支气管标本。2、组织块贴壁法培养人支气管平滑肌细胞(Airwaysmoothmusclecells，ASMCs)，光镜下观察和Q．actin细胞免疫组化进行ASMCs鉴定。3、构建携带野生型质粒PTEN的腺病毒载体，PCR、westernblot等鉴定载体构建的成功。3、使

7、用Transwell趋化小室检测ASMCs的跨膜迁移能力的变化。4、利用细胞划痕实验再次检测ASMCs迁移能力的变化。Ⅱ硕士学位论文5、FITC标记的鬼笔环肽标记F．肌动蛋白骨架，激光共聚焦扫描显微镜观察ASMCs细胞骨架的变化。6、Westernblot检测各组(Ad．PTEN组、Ad．GFP组、DMEM空白对照组)信号通路中磷脂酰肌醇一3-激酶(P13K)、细胞外信号调节激酶(EPic)及黏着斑激酶(FAK)磷酸化水平的改变，以反应相应信号通路在细胞迁移中的作用。7、采用SPSSl3．0统计软件进

8、行结果分析，统计数据用均数±标准差(x±S)表示，各处理组间比较用析因分析，P<0．05为差异有统计学意义。结果l、ASMCs的形态及免疫组化鉴定：倒置显微镜下单个ASMCs呈长梭形，贴壁生长至融合后，细胞呈现出特征的“峰、谷”状形态。细胞免疫组化平滑肌细胞表型标志物a．actin鉴定，光镜下可见细胞浆中较多棕黄色颗粒为染色阳性细胞。2、重组穿梭载体质粒、重组腺病毒质粒经过PCR酶切鉴定，得到我们所需的一条1．3kb小片断及酶切条带，腺病毒经过包装、扩增