血管紧张素ⅱ对血管平滑肌细胞中抑癌基因pten的影响与分子机制的研究

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1、of只；硕士学位论文殖与迁移，并且确定了AngII的最佳浓度和作用时间。经MTT法检测细胞活力，发现lI-tmol／L以及10I．tmol／L两个浓度的AngII作用12小时和24小时后均能显著促进平滑肌细胞增殖，而O．1l_tmol／LAngll作用不及另两个浓度。11上mol／LAngII增殖促进率为12小时13．6％郇O．001)，24小时13．9(p

2、滑肌细胞增殖的促进率分别为10．4％(p<0．01)和9．8％(p

3、紧张素Ⅱ对平滑肌细胞中PTEN及其通路的影响实验应用westernblot检测法及非还原电泳法检测AngII刺激细胞后，PTEN，phospho—PTEN(p--PTEN)，reduced-PTEN(re-PTEN)，oxidized—PTEN(ox—PTEN)及PTEN下游通路蛋白phospho-Akt(p-akt)和phospho—FAK(p-FAK)表达的变化。同时应用Realtime-PCR法检测PTENmRNA水平的变化。此外，应用还原型二氯荧光素(2’，7’．Dichlorofluor

4、escindiacetate,DCFH．DA)检测细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)水平的变化，考察自由基水平与re-PTEN和OX．PTEN表达的关系。结果显示，O．1lxrnoFL，1l_tmoFL以及lOltmoFL的Angll分别作用于血管平滑肌细胞24h时，细胞内PTEN蛋白的表达水平呈浓度依赖性降低。选用1ltmol／L的AngII作用于平滑肌细胞O-12h，PTEN的表达呈现时间依赖性的降低，12h时，其表达降低至正常对照组的1／4fas

5、。RT-PCR的检测结果显示1lunol／LAngII刺激细胞2h后PTENmRNA水平已降低至对照组的1／20<0．01)。说明AnglI可以从基因和蛋白水平降低PTEN的转录和表达。应用westernblot方法检测到，AngII刺激平滑肌细胞5min后可快速却短暂的升高p-PTEN的表达，2小时后趋于正常水平。向细胞内载入DCFH荧光探针，用AngII刺激后不同时间检测到的细胞内荧光强度反映细胞内活性氧水平。结果显示，AnglI刺激平滑肌细胞可以快速升高细胞内活性氧的水平，l小时后达到对照组

6、2o

7、}z鬈硕士学位论丈的1．5倍(p

8、O．001)。三、血管紧张素II影响平滑肌细胞内PTEN表达的机制研究预先用某些信号通路或因子的抑制剂、激动剂对平滑肌细胞进行预处理l小时，再加入11．tmoVL的Angll共同作用12小时，应用westernblot和CCK．8法考察各种调节剂对细胞内PTEN表达水平的影响及对平滑肌细胞增殖的影响，以此分析AngII影响PTEN表达水平的调控机制。westernblot检测结果显示，AngII受体抑制剂洛沙坦(10sartan，Losa)，过氧化物酶体增殖物激活受体Y(peroxisomepro

9、liferator-activatedreceptor-7，P队RY)激动剂罗格列酮(rosiglitazone,Rosi)及细胞核因子-r．B(nuclearfactor-rB，NF．zs)抑制剂BAYl1．7082可以使PTEN的表达恢复甚至高于正常组PTEN的表达；e-jim氨基末端激酶(e-jimNH2．terminalkinase，JNK)抑制剂SP600125组PTEN的表达较AnglI组也略有提高；抗氧化剂伍-硫辛酸(alpha-lipoicacid，a—LA)组细胞