pparγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因pten表达的影响

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1、PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响【关键词】PPARγ胰腺癌罗格列酮基因治疗　　近年胰腺癌发病率在国内外呈上升趋势,起病隐蔽,发展迅速,又缺乏有效的早期诊断和系统治疗方法,胰腺癌早期诊断以及治疗水平均较低,促使人们不断寻求其新型有效的治疗分子靶点[1]。目前,胰腺癌基因治疗还处于探索阶段,抑癌基因将在胰腺癌基因治疗中发挥重要作用。研究发现人类胰腺癌表达PPARγ,PPARγ配体可以抑制巨噬细胞的活化以及浸润,是肿瘤新生血管形成重要的调节因子[2],激活PPARγ能够产生抗胰腺癌生长的效应。PTEN基因,是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,参与细

2、胞周期调控,同时调节细胞正常生长和发育[3]。有研究表明50%的胰腺癌有染色体10q的缺失[1],而10q正是PTEN基因位点所在。近年来随着对肿瘤发病机制的不断深入研究,发现PPARγ、PTEN与胰腺癌发生、发展有着密切的联系。本研究中通过体外培养人胰腺癌细胞株,给予PPARγ激动剂罗格列酮,利用RTPCR、免疫细胞化学、流式细胞术（FCM）检测等方法,观察胰腺癌细胞株中抑癌基因PTEN表达的影响,为进一步探讨PPARγ抑制胰腺癌的机制提供一定的理论支持,为胰腺癌基因治疗提供新思路。　　1材料和方法　　1.1材料人胰腺癌细胞株PANC1（humanpancreat

3、iccancercells,PANC1）,购自意大利ISTBanca公司。RNA提取试剂（TRIzolReagent）、TaqDNA聚合酶、反转录酶SuperscriptⅢ、DL2000marke、DMEM培养基均为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。引物由大连宝生公司合成。格列酮为葛兰素史克公司产品。GEM培养液,800r/min离心5min,弃上清;细胞沉淀加入DMEM完全培养液（内含150mL/L胎牛血清、35.76g/LHEPES、青、链霉素各100U/mL）重悬,置于75cm2塑料瓶,在含50mL/LCO2的37℃孵箱里贴壁生长至融合,隔日换

4、液,当细胞生长至80%～90%融合时,用1.25g/L胰蛋白酶消化传代。选择生长良好的PANC1细胞,接种于6孔细胞培养板,接种密度为1×104/孔。　　1.2.3细胞总RNA的提取使用罗格列酮和GSO,pH7.4)处理空白对照组细胞。罗格列酮组,细胞培养体系中分别加入1μmol/L、10μmol/L罗格列酮溶液(1μmol/LDMSO),50mL/LCO2、37℃孵育2、6、12、24、48h;GSO),50mL/LCO2、37℃孵育48h。　　1.2.4RTPCR反应体系50μL按以下反应条件进行RTPCR反应:混匀,离心10s;94℃预变性5min;变性94

5、℃50s;退火60℃45s;延伸72℃90s;共25个循环;末次循环后,72℃再延伸10min;样品冷却后4℃保存。　　1.2.5琼脂糖凝胶电泳取PCR产物5μL,加1μL的loadingbuffer混匀,加入样品孔内;接通电源,DNA样品由负极向正极泳动,电压为5V/cm,30min后终止电泳;5mg/L溴化乙锭（EB）染色,凝胶成像仪观察图像。　　1.2.6细胞爬片的制备选择对数生长期PANC1细胞,用1.25g/L胰蛋白酶液消化制成单细胞悬液,调节细胞密度,将细胞接种于预先准备好玻片的培养皿中（0.1g/L多聚赖氨酸处理载玻片）;细胞分为罗格列酮和GSO,pH7

6、.4)处理。罗格列酮组,细胞培养体系分别加入1μmol/L和10μmol/L罗格列酮溶液(1μmol/LDMSO),50mL/LCO2,37℃孵育48h;GSO),50mL/LCO2,37℃孵育48h。待细胞再次进入对数生长期,取出玻片,PBS洗涤,4℃丙酮固定10min,PBS洗2遍,37℃烘干,-20℃冻存备用。　　1.2.7免疫组织化学染色免疫组织化学染色采用SABC法,具体步骤参考说明书进行。阴性对照用PBS代替一抗。荧光显微镜观察结果,细胞中出现棕黄色颗粒判为阳性。　　1.2.8FCM检测PTEN蛋白的表达选择生长良好的PANC1细胞,分为罗格列酮和GSO,

7、pH7.4)处理。罗格列酮组,细胞培养体系加10μmol/L的罗格列酮溶液(1μmol/LDMSO),50mL/LCO2,37℃孵育48h;GSO),50mL/LCO2,37℃孵育48h。1.25g/L胰酶消化PANC1细胞,制备悬液,调整细胞密度为1×109/L;1mL的PANC1细胞悬液中,分别加入PTEN抗体和IgG对照抗体（1μL,1∶200）,标记荧光,37℃水浴1h,PBS缓冲液离心冲洗;再加入20g/L多聚甲醛40μL固定。FCM测定PANC1细胞中PTEN蛋白表达的百分率。　　1.2.9统计学处理全部数据均以x±s表