pparγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因pten表达的影响

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1、PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响【摘要】目的:观察PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响。方法:体外培养人胰腺癌细胞株PANC1,使用罗格列酮和GW9662细胞分别处理PANC1细胞,RTPCR检测PANC1细胞中PTEN基因表达的变化;SABC法检测PTEN蛋白表达的变化,FCM法检测PTEN蛋白表达的百分率的变化。结果:PPARγ激动剂罗格列酮能够诱导抑癌基因PTEN的高表达,同时抑制剂GW9662能够抑制抑癌基因PTEN的表达,并呈一定的量效关系。结论:胰腺癌

2、细胞中PPARγ的表达与抑癌基因PTEN的表达呈一定的平行关系,PPARγ可能通过一定信号转导通路调节抑癌基因PTEN的表达,从而发挥抗肿瘤的作用。【关键词】PPARγ胰腺癌罗格列酮基因治疗　　近年胰腺癌发病率在国内外呈上升趋势,起病隐蔽,发展迅速,又缺乏有效的早期诊断和系统治疗方法,胰腺癌早期诊断以及治疗水平均较低,促使人们不断寻求其新型有效的治疗分子靶点[1]。目前,胰腺癌基因治疗还处于探索阶段,抑癌基因将在胰腺癌基因治疗中发挥重要作用。研究发现人类胰腺癌表达PPARγ,PPARγ配体可以抑制巨噬细胞的

3、活化以及浸润,是肿瘤新生血管形成重要的调节因子[2],激活PPARγ能够产生抗胰腺癌生长的效应。PTEN基因,是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,参与细胞周期调控,12同时调节细胞正常生长和发育[3]。有研究表明50%的胰腺癌有染色体10q的缺失[1],而10q正是PTEN基因位点所在。近年来随着对肿瘤发病机制的不断深入研究,发现PPARγ、PTEN与胰腺癌发生、发展有着密切的联系。本研究中通过体外培养人胰腺癌细胞株,给予PPARγ激动剂罗格列酮,利用RTPCR、免疫细胞化学、流式细胞术（FCM）

4、检测等方法,观察胰腺癌细胞株中抑癌基因PTEN表达的影响,为进一步探讨PPARγ抑制胰腺癌的机制提供一定的理论支持,为胰腺癌基因治疗提供新思路。　　1材料和方法　　1.1材料人胰腺癌细胞株PANC1（humanpancreaticcancercells,PANC1）,购自意大利ISTBanca公司。RNA提取试剂（TRIzolReagent）、TaqDNA聚合酶、反转录酶SuperscriptⅢ、DL2000marke、DMEM培养基均为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。引物由大连宝生

5、公司合成。格列酮为葛兰素史克公司产品。GW9662为Sigma公司产品。PTENantibody、二抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记为武汉博士德公司产品。　　1.2方法　　1.2.1引物设计12通过人PTEN信号肽和编码区基因序列设计引物,在GenBank中获得所需PTEN的基因序列,由大连宝生生物技术有限责任公司合成。人PTEN的基因序列:senseprimer5′CCAGACATGACAGCCATC3′;antisenseprimer5′GAACTTGTCTTCCCGTCG3′。人βactin

6、的基因序列:Senseprimer5′GAGGATCTTCATGAGGTAGTCTGTCAGGTC3′;antisenseprimer5′CAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCA3′。　　1.2.2细胞培养PANC1细胞从液氮中取出后,迅速置于37℃水浴解冻复苏,加入37℃预热无血清DMEM培养液,800r/min离心5min,弃上清;细胞沉淀加入DMEM完全培养液（内含150mL/L胎牛血清、35.76g/LHEPES、青、链霉素各100U/mL）重悬,置于75cm2塑料瓶,

7、在含50mL/LCO2的37℃孵箱里贴壁生长至融合,隔日换液,当细胞生长至80%～90%融合时,用1.25g/L胰蛋白酶消化传代。选择生长良好的PANC1细胞,接种于6孔细胞培养板,接种密度为1×104/孔。　　1.2.3细胞总RNA的提取使用罗格列酮和GW9662细胞分别处理PANC1细胞,使用PBS溶液(含1μmol/LDMSO,pH7.4)处理空白对照组细胞。罗格列酮组,细胞培养体系中分别加入1μmol/L、10μmol/L罗格列酮溶液(1μmol/LDMSO),50mL/LCO2、37℃孵育2、

8、6、12、24、48h;GW9662组,细胞培养体系中加入10μmol/LGW9662溶液(1μmol/LDMSO),50mL/LCO2、37℃孵育48h。12　　1.2.4RTPCR反应体系50μL按以下反应条件进行RTPCR反应:混匀,离心10s;94℃预变性5min;变性94℃50s;退火60℃45s;延伸72℃90s;共25个循环;末次循环后,72℃再延伸10min;样品冷却后4℃保存。　　1.2.5