血管紧张素ⅱ对herg钾通道的慢性调节机制研究

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1、河北医科大学硕士学位论文血管紧张素Ⅱ对hERG钾通道的慢性调节机制研究姓名：蔡玥申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：许彦芳；张咏梅201203中文摘要血管紧张素II对hERG钾通道的慢性调节机制研究摘要心肌肥厚、心力衰竭是冠心病、心瓣膜病、高血压等多种心血管病的常见合并症。心肌肥厚、心力衰竭时发生的病理性电重构使心脏的电不稳定性增加，常伴发各种心律失常。心衰病人在泵功能稳定的情况下半数以上因发生恶性心律失常而猝死(即心源性猝死SuddenCardiacDeath，SCD)。因此，阐明病理情况下心

2、律失常产生机制，寻找药物作用靶点具有重要意义。已知心肌肥厚、心力衰竭病理发展过程中全身和局部的肾素．血管紧张素系统(renin．angiotensinsystem，RAS)活性增加是病理性组织重构重要的原因，该系统的关键成分血管紧张素II(AngII)主要通过激活ATl受体从而激活多种细胞内信号通路，对心血管功能发挥广泛的调节作用。实验证明，过表达人AnglI基因的大鼠常因严重室性心动过速而猝死；在急性分离的犬和大鼠的心室肌细胞、以及转染编码k通道基因Kv4．3N-孚D细胞上，AngII均可使厶。电

3、流密度减小。上述研究结果提示，AngII通过刺激ATl受体直接引起离子通道的改变导致病理性电重构是心律失常发生的重要原因。哺乳类动物心室肌细胞延迟整流钾电流在动作电位复极化过程中发挥关键作用，其中快激活成份(砧)通道孔区亚单位由human'ether-a-go-go’relatedgene基因(简称hERG)编码，此种hERG钾通道由于特殊的动力学特征对动作电位形状、时程具有重要影响。疾病状况下该通道功能下调引发动作电位时程延长和／或形状改变是室性心律失常发生的重要原因。bERG钾通道由于本身的缺陷

4、或者药物的影响而发生变异或功能异常，产生先天性LQTS和获得性LQTS，均有较高尖端扭转型室性心律失常和猝死的危险。在前期的研究我们观察至UAngII对豚鼠心室肌细胞比和表达的kRG呈现急性抑制作用，提示AnglI可能通过直接下调比参与病理条件下电生理重构。已矢NAngII可激活多条细胞内信号通路引发急性和慢性生物效应，慢性效应发生在数小时甚至更晚时间，常涉及蛋白基因转录及转录后的改中文摘要变。我们已证明An西I长时间作用(>12h)可使表达的hERG钾通道成熟膜蛋白明显减少。那么，AnglI下调通

5、道膜蛋白含量潜在的机制尚不清楚。新近实验证明，慢性刺激一些G蛋白偶联受体对hERG钾通道发挥明显的转录后调节作用。因此，本研究主要利用分子生物学的方法，在前期研究AnglI作用的基础上又在异源表达系统上进一步研究ATl受体刺激对hERG钾通道的转录后调节作用(包括如何影响hERG钾通道蛋白正向转运及膜蛋白入胞降解等转录后调节过程而改变细胞膜蛋白含量)并对AngII下调hERG钾通道膜蛋白量的信号传导机制进行分析，这对理解离子通道病理重构机制从而解释心律失常发生机制具重要理论意义。第一部分血管紧张素I

6、I对hERG钾通道转录后调节作用目的：研究AnglI对hERG钾通道转录后的调节作用。方法：(1)Lipofectamine2000瞬时转染：将ATl受体质粒转染到稳态转染的hERG．}Ⅱ三K293细胞上，或将ATl受体质粒与hERG质粒以1：1的比例瞬时转染到HEK293细胞上。(2)细胞免疫荧光：将细胞用4％多聚甲醛固定后，用0．2％TritonX．100透化处理(不做透化处理省略这一步)，之后用PBS配制含5％BSA的封闭液进行封闭，加入特异性一抗和FITC标记的二抗，用共聚焦显微镜观察显色情

7、况。(3)Westernblot：将提取的细胞总蛋白进行SDS．PAGE电泳，电转移到NC膜上，用TBST配制含5％脱脂牛奶进行封闭，加入特异性一抗和红外荧光标记的二抗，用双色红外激光成像系统仪器扫描。(4)In—cellwestem：将细胞用4％多聚甲醛固定后用TBST配制含5％脱脂牛奶封闭，加入特异性一抗和红外荧光标记的二抗，用双色红外激光成像系统仪器扫描。结果：(1)Westernblot检测到目的条带约在65kDa出现，与ATl受体分子量大小基本一致。提示ATl受体在hERG．HEK293细

8、胞中成功表、t达。(2)AnglI长时间孵育对bERG钾通道蛋白含量影响：AnglI(100nM)孵育24小时后In．cellwestern检测显示膜上成熟蛋白减少为(690／社4％，P<0．01)；细胞免疫荧光染色共聚焦显微镜下观察通道蛋白在细胞膜和细胞内分布情况，发现AnglI使未透化处理过的细胞膜上的荧光明显减少，中文摘要透化处理过的细胞膜荧光减少，胞浆荧光变化不明显。(3)AngII对bERG钾通道蛋白正向转运的影响：AnglI孵育24h后westernblo