血管紧张素ⅱ对kcnq1kcne1钾通道蛋白表达的调节

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1、河北医科大学硕士学位论文血管紧张素Ⅱ对KCNQ1/KCNE1钾通道蛋白表达的调节姓名：左旭申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：许彦芳201203中文摘要血管紧张素II对KCNQl／KCNEl钾通道蛋白表达的调节摘要延迟整流钾电流IK是人和哺乳动物的心室肌细胞动作电位主要的复极外化向钾电流，其中包括两种电流成分：慢激活(Slowdelayedrectifierpotassiumcurrent，忆)和快激活(Rapiddelayedrectifierpotassiumcurrent，如)。目前认为KCNQl编码的a亚单位和KCNEl编码的p亚单位共

2、同构成I融钾通道。KCNQl属于Kv钾通道家族KCNQ成员之一(KCNQl．5或Kv7．1．7．5)。KCNQl异源表达能产生快激活、慢失活的外向电流。迄今发现的五种KCNE蛋白都能够对KCNQl通道功能起不同的调节作用，其中KCNQl／KCNEl异源表达形成慢激活、慢去激活、无失活的电流，其电流动力学特征和药理学特征与心脏的I风通道很相似。业已证明，KCNQI及KCNEl基因突变是引发离子通道病的分子遗传基础，包括通道功能下调相关的长QT综合征(LQTl、LQT5)或功能上调引发的短QT综合征(SQT2)。同时，越来越多的证据显示，许多心血管疾病

3、状态下，如心肌肥厚，心衰等伴有IKS通道功能的下调，是获得性LQT产生的重要原因之一。无论是复极延迟的LQT或是复极缩短的SQT，都可能导致心律失常，特别是尖端扭转型室性心动过速，是高发心源性猝死的危险。因此研究I心通道功能调节具有重要的意义。肾素一血管紧张素系统(renin．angiotensinsystem，RAS)在调节心血管系统的正常生理功能以及高血压、心肌肥大、充血性心力衰竭等诸多心血管的病理过程中具有重要作用。血管紧张素II(AnglI)是其该系统的主要体液因子，近年的研究表明AngII对心肌离子通道功能具有直接调控作用。在先前我们的试

4、验中，发现AnglI通过激活ATl受体对豚鼠心室肌细胞上IK。呈急性下调，已知ATl受体激动产生的效应包括急性作用(发生在几分钟内)和慢性作用，后者常常为基因转录和转录后调节。然而AnglI对IK。通道的慢性调控作用尚不清楚。本研究用分子生物学、免疫荧光显微镜等实验技术，在异源表达体人胚胎肾细胞(髓怼93)上共表达人的KCNQl、KCNEl以及人ATl受体cDNA，24h后，观察AnglI对KCNQl／KCNEl通道慢性调控作用，并分析了细胞内的信号转导通路中文摘要第一部分AngII对KCNQl通道蛋白表达的影响目的：观察不同浓度及不同时间AnNI

5、对KCNQl通道蛋白表达的影响。方法：在HEK293细胞上运用Lipofectin2000转染试剂瞬时共转染带标签的V5．KCNQl或Myc．KCNQl、KCNEl及人ATl受体cDNA，24h后，运用特异性抗标签抗体，westernblot技术检测AnglI在不同浓度、不同时间对KCNQl通道蛋白表达的影响。运用免疫荧光共聚焦显微镜技术观察An出I对细胞膜上通道蛋白表达的影响。结果：(1)AngII与细胞孵育24h可明显降低KCNQl蛋白含量，AngII在10、100、1000nM浓度下蛋白含量分别是对照的80％、68％、67％，；(2)AngI

6、I(100nlVI)不同时间(2、6、12、24h)孵育后通道蛋白的下调出现在12小时；(3)免疫荧光实验进一步证实，给予AngII(100nM)24h后，细胞膜上的通道蛋白荧光强度明显减弱。结论：在异源表达系统，长时间孵育Ang1I能够引起KCNQl通道蛋白的表达量下降。第二部分PKC信号通路对AngII作用的影响目的：异源表达细胞线上分析An百I对KCNQl通道慢性调控作用的细胞内信号转导通路。方法：采用脂质体瞬时转染方法，在HEK293细胞共转染带标签的V5．KCNQl、KCNEl及人ATl受体cDNA24h后，运用特异性抗标签抗体，west

7、ernblot技术检测观察使用PKC抑制剂或激动剂对AngII下调KCNQl通道蛋白表达的影响。结果：(1)PKC抑制剂Bis．1(100nM)与细胞孵育30min后再加入AngII(100nM)共同作用24h，与单独孵育AngII相比通道蛋白表达含量出现了明显增加现象，说明Bis．1可拮抗AngII的作用；(2)PKC激动剂PMA(100nM)细胞孵育30min后再加入AngII(100nM)共同作用24h，与单独孵育AngII相比通道蛋白表达量亦明显增加，其蛋白含量为对照组的97％，表明长时间孵育PMA使PKC耗竭后可拮抗AngII的作用；(3

8、)单用PKC激动剂PMA分别作用细胞30min及24h，PMA作用30min的蛋白含量为对照相的49％，而24h蛋白的表达