血管紧张素ⅱ对人心脏微血管内皮细胞神经调节蛋白1表达和分泌的影响

《血管紧张素ⅱ对人心脏微血管内皮细胞神经调节蛋白1表达和分泌的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、血管紧张素Ⅱ对人心脏微血管内皮细胞神经调节蛋白1表达和分泌的影响陈威丞1芮蕾2温汉春2朱继金21.广西医科大学第一附属医院心血管研究所，广西南宁530021；2.广西医科大学第一附属医院急诊科，广西南宁530021基金项目：国家临床重点专科建设项目（卫办医政函［2012］649号）。【摘要】目的：探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对人源性心脏微血管内皮细胞（HCMECs）的影响。方法：在正常培养条件下，将100nmol/LAngⅡ加入细胞中，与HCMECs共孵育12h，用蛋白印迹法检测和细胞酶联免疫法分别检测神经调节蛋白1（NRG-1）的蛋白

2、表达和神经调节蛋白1亚集（NRG-1β）分泌情况。结果：与空白组比较，AngⅡ处理组的NRG-1的蛋白表达和NRG-1β的分泌降低（P＜0.05）。结论：AngⅡ能减少HCMECs的NRG-1的表达和NRG-1β分泌。.jyqkl（编号8248），双抗（编号0106），纤维连接蛋白原液（编号0103），内皮细胞生长添加剂(编号0113)，胰酶（编号0113）（上述试剂全购自美国Sciencell公司），DMEM低糖培养基（编号31600-034，购自Gibco公司），NRG-1抗体（编号MAB3771，购自美国RD公司），内参抗体GAP

3、DH（编号FL-335：ZS25778，购自中国中杉金桥公司），人源性NRG-1β酶联免疫吸附测定法试剂盒（编号119-14819，购自美国RayBiotech公司），超低温冰箱（DECs培养细胞复苏前准备一瓶含有纤维膜的培养瓶（复苏前2h在空培养瓶25cm，加入4ml无血清的培养基，然后加入25μl纤维连接蛋白原液，放入37℃培养箱培养，培养2h以后取出液体，造纤维膜成功）取人源性心脏微血管内皮细胞株常规复苏后，本研究室常规传代培养，每瓶培养瓶都用25μl纤维连接蛋白原液，造出纤维膜，37°C、5%CO2培养。当细胞生长成单层达80%

4、到90%的培养面积，用0.25%胰酶消化，传代，用5、6代HCMECs用于实验。1.3蛋白免疫印迹检测NRG-1蛋白表达收集各组细胞分别装入到小EP管中，加入裂解液和PMSF提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白的浓度，取蛋白样品10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，待电泳完毕，NRG-1用100mA的电流转膜，内参转60min，NRG-1转90min，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，在室温下用脱脂奶粉封闭后，分别加入鼠抗人多克隆抗体NRG-1（1∶500），4°C孵育过夜，漂洗后加二抗（1∶5000），37℃孵育1h，漂洗后去暗室X光胶片曝光

5、，加入ECL发光剂，暗房显影，用QuantityOne软件分析目标条带的灰度值，以目标条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为目的基因蛋白的相对表达量。1.4酶联免疫吸附测定法检测NRG-1β蛋白的分泌收集各组细胞培养液分别装入到3KD的millipore蛋白离心管中，在角度转子离心机中温度调定为4°C，用5000离心力离心1h，剩余大概250μl左右，放入-80℃冰箱备用。使用前将所有的试剂和样品放在室温中0.5h，将准备好的100μl标准品和样品分别加入到相应的孔中，盖好以后，在室温中轻轻摇动孵育2.5h，弃去溶液，用已经准备好的300

6、μl洗涤液洗4次，最后一次洗涤要把洗涤液完全移去，然后加入100μl制备好生物素标记抗体到每个孔中，在室温中轻轻摇动孵育1h，弃去溶液，用每次300μl洗涤液洗4次，弃去溶液并加入制备好的HRP溶液到每个孔中，在室温中轻轻摇动孵育45min，弃去溶液，每次用300μl洗涤液洗4次，然后加入100μlTMB到每个孔中，避光轻轻摇动在室温里孵育30min，加入50μl终止液到每孔，在450nm读数。1.5统计学处理采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。主要试验数据来自3次以上重复试验，以均数±标准差(x±s)表示，对主要指标进行正态性

7、分布检验，符合正态分布的多组间样本比较采用单因素ANOVA检验，用LSD方法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1光镜下细胞形态观察倒置显微镜下观察HCMECs生长成一个融合单层，细胞的形态呈菱形和多边形。如图1。3讨论本研究发现，AngⅡ明显减少HCMECs的NRG-1表达和NRG-1β分泌。在成人心脏中，NRG-1主要由内皮细胞和微血管内皮细胞表达和释放，而在大的冠状动脉、静脉及主动脉却不表达。内皮功能不全的一个重要的特征是一氧化氮/内皮素水平导致的内皮收缩舒张血管功能异常。在各种病理因素的作用下，内皮细胞

8、可以分泌多种内源性活性物质促进动脉粥样硬化斑块和血栓的形成。有研究证实，冠状动脉内皮功能失调与脂质斑块形成有关［2］。有大量的实验研究表明，心内膜和冠状微血管中的心脏血管内皮细胞直接影响心脏的机械性能、生长