血管紧张素ⅱ对人肺微血管内皮细胞核因子-kb活化作用

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1、血管紧张素Ⅱ对人肺微血管内皮细胞核因子-kB活化作用王　连　邱海波　杨　毅　丁惠民　刘　玲　李红鹏[摘要]目的探讨不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在不同时间点对人肺微血管内皮细胞(HPMEC)核因子－KB(NF-KB)的活化作用。方法采用原代培养的HPMEC，分别以浓度为lO-8、10-7、10-6、10-5moL・L-1的AngⅡ刺激HPMEC0、0.5、1、2、4h，用凝胶电泳迁移率实验(EMSA)观察NF-KB对DNA的结合活性。结果各浓度组AngⅡ均能活化HPMEc中NF-KB；与0h比较，AngⅡ10-8mo

2、l・L-1组在4h表现出明显的NF-kB活化作用(P80％后，弃去培养基，换无血清ECM培养基培养24h进行实验。实验分为5组：AngⅡ10-8、AngⅡ10-7、AngⅡ10-6、AngⅡ10-5mol・L-1浓度组和对照组。以不同浓度的AngⅡ刺激HPMECO、0.5、1、2、4h后提取细胞核蛋白，其中对照组(0h组)加入等量无血清ECM。各组实验重复6次。61.2.3　细胞核蛋白提取至预定时间点时胰酶处理和收集贴壁培养的细胞，低速离心，用冷PBS冲洗1次，按照蛋白抽提试剂说明书依次加入蛋白抽提液、蛋白酶抑制剂和D

3、TF(二硫苏糖醇)，收集细胞裂解产物并高速离心，提取细胞核蛋白，加入考马斯亮蓝G250染液，Bradford法测定蛋白浓度。将上述细胞提取液调整蛋白浓度至100μg・ml-1，标本分装后一70度冻存。以上操作均在冰上进行。1.2.4　凝胶电泳迁移率分析(EMSA)实验测定NF-KB活性(1)双链寡核苷酸探针的标记：依次加入寡核苷酸探针(1.75pmol・μl-1)2μl，10×T4多核苷酸激酶缓冲液1μl，T4多核苷酸激酶(10u・μl-1)lμl，[γ-32P-ATP]ATP(0.37GBq・ml-1)4.0μl，无

4、核酸酶水2μl，将10μl反应混合液置37度孵育45min。再向上述反应体系中加入1μl的T4连接酶，37度下孵育10min，加入1μlEDTA(0.5mol・L-1)终止反应，然后加入89μlTE缓冲液(10mmol・L-1Tris-HCl，1mmol・L-1ED-TA，pH8.0)。-20度保存标记的探针。(2)核蛋白样本NF-KB活性测定：按照GelShiftAssaySystems说明书，2μl核蛋白提取液和5倍的结合缓冲液混合后于37度孵育10min，再加入1μl标记寡核苷酸探针于37度反应45min。DNA

5、-蛋白复合物经4％聚丙烯酰胺凝胶于240V电泳40min，取出凝胶，烘干，放入片盒，压x线片，-70度放射自显影10h。在凝胶电泳率实验中设特异性和非特异性竞争性对照，即在反应体系中加入200倍未标记的特异性NF-KB探针和未标记的转录因子sP-l序列寡核苷酸探针，室温下置10min后加入标记探针再孵育电泳。将显影结果经扫描仪扫入计算机中，进行密度扫描及面积积分，以灰度积分值对NF-KB活性进行半定量。61.3　统计学处理灰度积分值表示，数据采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意

6、义。2结果2.1　NF-KB竞争抑制实验采用未标记的转录因子SP-1序列寡核苷酸探针进行非特异竞争，未标记的NF-KB结合序列寡核苷酸探针进行特异性竞争试验，非特异性竞争不能抑制结合反应，而特异性竞争试验明显抑制结合反应，表明这一结合反应为NF-KB特异性。2.2　各AngⅡ浓度组在0、0.5、1、2、4h对NF-KB活化的影响EMSA结果显示：与对照组(0h)比较，在AngⅡ刺激后各AngⅡ浓度组HPMEC的NF-KB活化水平有不同程度升高。AngⅡ10-8mol・L-1浓度组在4h后HPMEC的NF-KB活性才开始

7、发生显著升高(P<0.05)；AngⅡ10-7。mol・L-1浓度组在1hHPMEC的NF-KB开始发生显著性的核转位，2h持续上升，NF-KB活化水平在4h时仍呈上升趋势(与2h比较，P<0.05)；AngⅡ10-6mol・6L-1浓度组1h时HPMEC的NF-KB发生显著性的核转位，NF-KB活化水平在2h达到峰值，约为基础值的3.5倍，随后开始下降，在4h时与1h的水平无差异，但仍高于基础状态(P<0.05)；AngⅡ10-5mol・L-1浓度组0.5h时NF-KB即明显活化，随后呈下降趋势，4h时NF-KB活化

8、效应仍明显高于对照组(P<0.05)。3讨论目前认为肾素．血管紧张素系统(RAS)不但是一个循环内分泌系统，而且在许多组织器官如大血管平滑肌细胞、心肌细胞、肾脏、脑和肺等存在局部RAS系统。对心血管系统及肾脏的大量研究显6示，RAS系统中的关键成分――AngⅡ除具有收缩血管、调节水盐代谢、导致高血压发生、促进组织及血管平滑肌增生等