反义c┐myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖论文

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1、反义c┐myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖论文.freelyc基因;反义核酸;大鼠;平滑肌摘要:目的观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠气道平滑肌增殖的抑制作用.方法大鼠气道平滑肌细胞原代培养，4～12代用于实验.利用Lipofectin将正义、反义及错配c-myc寡核苷酸导入大鼠气道平滑肌细胞，MTT法检测不同寡核苷酸对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用，RT-PCR检测c-mycmRNA的表达，免疫组织化学染色检测c-Myc蛋白的表达.结果反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖，且这种抑制作用呈浓度依赖性;

2、反义c-myc寡核苷酸可降低c-mycmRNA的表达，同时降低了c-mycmRNA的翻译.结论反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌的增殖.Keyyc;oligonucleotide.freeluscle，smoothAbstract:AIMToobservetheantiproliferativeeffectofc-mycantisenseoligonucleotideonratairoothmusclecells.METHODSRatairoothmusclecellsarycultured.4～12passage

3、sents.Lipofectinismatchedoligonucleotideforc-myctoratairoothmusclecells.TheantiproliferativeeffectycmRNA.c-Mycmunohistochemistrystaining.RESULTSAntisenseoligonucleotideforc-myccouldinhibittheproliferationofratairoothmusclecells，andthiseffectyccouldde-creasetheexpr

4、essionofc-mycmRNA.Thetranslationofc-mycyccouldinhibittheproliferationofratairoothmusclecells.0引言气道重塑（airodelling）在哮喘发病过程中有重要作用，包括气道上皮和气道平滑肌细胞（airoothmusclecells，ASMC）的增殖［1］.原癌基因是各种细胞内信号转导的最后共同通道，是参与气道重塑的重要因素.我们拟利用反义c-myc寡核苷酸阻断细胞增殖，达到抑制ASM增生、缓解气道重建的目的.1材料和方法1.1材料主要

5、试剂及仪器:Ⅳ型胶原酶、兔抗鼠actin抗体、MTT:Sigma公司;DMEM，Lipofectin，TRIZOL:Gibcobrl公司;胎牛血清:杭州四季青生物制品工程公司;AccessRT-PCR试剂盒:Promega公司;核酸水平电泳仪:美国BIO-RAD公司;反义、正义及错配c-myc寡核苷酸由美国GenemedSynthe-sis，Inc.合成，其核苷酸序列分别如下:5’CACGTTGAGGGGCAT3’，5’CACGTGGAGTGGCAT3’和5’ATGCCCCTCAACGTG3’，每条寡核苷酸的末端两个碱基间

6、行硫代修饰.另合成5’端FITC标记的反义c-myc寡核苷酸.1.2方法1.2.1大鼠ASMC的分离与培养健康、雄性SD大鼠1只（第四军医大学实验动物中心提供），体质量260g，脊椎脱臼法处死，无菌剥离气管及气管内、外膜，剪碎剩余组织块约为1mm×1mm×1mm大小，2gL-1Ⅳ型胶原酶37℃消化2次，每次30min，中间吹打组织块1次，100目不锈钢滤网过滤.100mLL-1胎牛血清高糖DMEM培养.1.2.2ASMC的纯化经原代培养后，细胞呈多克隆生长，选择细胞形态呈梭形的克隆在倒置显微镜下机械分离.分离所得细胞继续培

7、养1代，2.5gL-1胰酶短暂消化，1∶3传代，静置细胞30min，去除未贴壁细胞，利用平滑肌细胞容易贴壁的特性进一步纯化所得细胞.1.2.3大鼠ASMC的鉴定ASMC离体培养时呈梭形，有较长的突起，细胞核位于细胞中央，排列成旋涡状、放射状或栅栏状.培养细胞经SABC免疫组织化学鉴定.取4～12代于对数生长期的细胞用于实验.1.2.4反义c-myc寡核苷酸导入细胞的证实按1×107L-1接种细胞，48h后导入FITC标记的反义c-myc寡核苷酸（2mgL-1），继续培养9h，弃培养液，PBS漂洗2次，每次5min，荧光显微

8、镜下观察反义c-myc寡核苷酸进入细胞内情况.1.2.5反义c-myc寡核苷酸与Lipofectin不同比例的实验观察实验步骤如上，分别观察反义c-myc寡核苷酸与Lipofctin的质量比为2∶0，2∶1，2∶5，2∶10及2∶20时的转染效果，确定后续实验二者最佳比例.1.2.6反义c-myc寡核苷