川芎嗪抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用

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1、川芎嗪抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用【关键词】川芎嗪注射液;黏附分子;信号转导;血管平滑肌细胞　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheTetramethylpyrazine(TMP)mediatingantiproliferationeffect，anddefineitsmolecularmechanisminculturedrataorticvascularsmoothmusclecells(VSMC).MethodsCulturedcellsproliferatingmodelofratsVSMClydividedin

2、tothreegroups:control,PDGF(20ng/ml)andTMPtreatment(20,40,80μmol/L)groups.ThenumberofVSMCicroscope.Theexpressionofintercellularadhesionmolecular1(ICAM1)andintegrinlinkedkinase(ILK)anner.AremarkabledecreaseofICAM1andILKexpressiononstratedintheTMPgroupparedolecules.　　【Keyolecules;Si

3、gnaltransduction;Vascularsmoothmusclecells(VSMC);Rat　　川芎嗪是从具有活血化瘀作用的中药川芎中分离得到的一种生物碱，化学组分为四甲基吡嗪，目前已在临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗。我们前期研究证明，川芎嗪通过作用于血管平滑肌细胞(VSMC)而发挥活血化瘀的作用〔1〕，但缺乏在分子水平上阐明其机制的研究。细胞间黏附分子(ICAM)是一类介导细胞与细胞间或细胞与细胞外基质间相互作用的膜表面糖蛋白，在单核细胞及血小板的黏附聚集过程中发挥着重要的作用，与细胞增殖密切相关〔2〕。本研究用血小板源性生长因子(PDGF)刺激

4、体外培养的大鼠VSMC复制细胞异常增殖模型，从抑制黏附分子信号传递角度探讨川芎嗪抗VSMC增殖的机制，为从分子水平上阐明其活血化瘀作用机制提供实验依据，明确其作用靶点。　　1材料与方法　　1.1材料健康雄性5周龄SD大鼠，体重(100±10)g，由河北省实验动物中心提供。川芎嗪注射液(40mg/2ml)由北京第四制药厂提供。DMEM培养基、胎牛血清FBS由Gibco公司提供。PDGF、小鼠抗ICAM1单克隆抗体、小鼠抗整合素耦联激酶(ILK)单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗、发光试剂等均购自美国SantaCruz公司。其他化

5、学试剂均为进口或国产分析纯。　　1.2VSMC的培养5周龄雄性SD大鼠用25%乌拉坦按照0.4ml/100g体重进行腹腔注射麻醉，于无菌条件下取大鼠的胸腹主动脉。用0.01mol/LPBS洗净管腔内血液并剥脱血管外膜后，按贴块法分离培养VSMC。待细胞爬满培养瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，用光镜及免疫组化的方法进行细胞鉴定。取3～6代细胞进行实验。　　1.3细胞分组取传代培养的VSMC接种于细胞培养瓶中。待VSMC在含10%胎牛血清的DMEM培养液中生长至60%～70%融合时，换无血清培养基饥饿培养24h，使细胞同步化

6、于静止期。实验随机分为对照组、PDGF刺激组和川芎嗪组。对照组单纯加入培养液5ml;PDGF刺激组添加PDGF使其终浓度为20ng/ml;川芎嗪组先用不同浓度(20、40、80μmol/L)的川芎嗪注射液预孵育1h，然后再加PDGF(20ng/ml)刺激24h。收集各组细胞进行实验。　　1.41的表达1的灰度值表达量很小，PDGF刺激组ICAM1的表达量显著增加。川芎嗪组ICAM1的表达量与刺激组相比明显减少，仅相当于其的44%(P<0.05)，见图1。图1ICAM1和Western印迹检测结果　　川芎嗪是伞形科植物川芎的主要成分，具有活血化瘀的

7、作用，因可与其他中药组成方剂，故广泛应用于心脑血管疾病的救治。大量研究表明川芎嗪可抑制VSMC的异常增殖，但对其确切的分子机制目前尚不很清楚。现已明确，动脉粥样硬化等血管增殖性疾病的主要病变特征是血管平滑肌细胞向内膜下迁移与增殖、血小板的黏附聚集、单核/巨噬细胞浸润等，黏附分子及其受体的相互作用是引发这一系列慢性炎症过程的主要生物学机制。因此，如何抑制黏附分子的表达或阻断其功能已经成为研制抗血管增殖性疾病的新靶标〔3〕。　　单核细胞在血管内皮黏附并向内皮下迁移和泡沫化被认为是动脉粥样硬化的早期病理过程。ICAM1是单链跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，分子量

8、为80～110kD，其受