罗格列酮对cxcl16诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

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1、罗格列酮对CXCL16诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用　研究表明CXC趋化因子配体16(CXCchemokineligand16，CXCL16)作为一种新的趋化因子配体，能够促进动脉平滑肌的增殖〔1〕。罗格列酮(RSG)作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的激动剂抑制血管平滑肌细胞的增殖〔2〕。本研究通过观察RSG对CXCL16诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响，验证其在血管平滑肌增殖中的作用，并进一步探讨其机制。　　1材料与方法　　1.1材料成年大鼠，雌雄不限(由吉林大学实验动物中心提供)。RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生

2、物工程材料有限公司)，重组鼠CXCL16(美国RDsystems公司)，LY294002(美国BioVision公司)，吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)(美国Sigma公司)，兔抗大鼠α平滑肌肌动蛋白(αSMA)多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司)，兔抗大鼠CXCL16多克隆抗体(美国SantaCruz公司)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。RTPCR试剂盒(立陶宛MBIFermentas公司)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1大鼠髂主动脉平滑肌细胞的分离与培养经水合氯醛麻

3、醉后，颈动脉放血处死动物。在无菌操作条件下迅速取出全部髂段主动脉，立即置于冷DHank′s液中，用眼科镊仔细剥离近外膜侧1/3处含成纤维细胞多的外膜后，放在无菌的玻璃纸上固定后，纵形剖开血管，用锋利刀片轻轻刮除多余脂肪及内膜，DHank′s液洗涤，放入培养皿中，用眼科剪剪成1mm×1mm×1mm大小，将小组织块均匀铺于培养瓶壁，置于CO2孵箱。待组织块贴壁牢固后，再加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养。　　1.2.2平滑肌细胞的传代及鉴定待细胞生长至瓶底的80%以上后，吸弃培养液，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)充分清洗3次。加入0.25%胰蛋白酶少许，室温下

4、将培养瓶置于倒置显微镜下观察。待细胞回缩、细胞间隙增大后，立即用含10%胎牛血清的培养液终止消化，吸除消化液，加PBS液，轻轻转动培养瓶，除去残余消化液。加入培养液，用吸管轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之脱落瓶壁形成细胞悬液，分装后继续培养。取其4～6代细胞用兔抗大鼠αSMA多克隆抗体对其进行鉴定。　　1.2.3用细胞计数法检测CXCL16对平滑肌细胞增殖的影响以1×104/ml个细胞接种于24孔培养板，用浓度为50ng/ml的CXCL16分别作用于平滑肌细胞1、2、4及8d，用细胞计数法测定平滑肌细胞的增殖情况。仅含10%胎牛血清的RPMI1640培养液作为阴性对照;含20n

5、g/ml血小板生长因子(PDGF)BB的上述培养液作为阳性对照。　　1.2.4药物处理取1.2.2传代细胞，分为5组，用不同药物进行处理。空白对照组(1组)：RPMI1640培养液(含10%胎牛血清)培养细胞。CXCL16组：在1组培养液基础上加入终浓度为50ng/mlCXCL16。PI3K/Akt特异性抑制剂组(CXCL16+LY294002)：在1组培养液基础上加入终浓度为20μmol/LLY294002，作用1h后，再加入终浓度为50ng/mlCXCL16。核转录因子(NFκB)特异性抑制剂组(CXCL16+PDTC)：在1组培养液基础上加入终浓度为100μmol

6、/LPDTC，作用1h后，再加入终浓度为50ng/mlCXCL16。RSG组(CXCL16+RSG)：在1组培养液基础上加入终浓度为20μmol/LRSG，作用1h后，再加入终浓度为50ng/mlCXCL16。每组至少重复3次。　　1.2.5噻唑蓝(MTT)法检测血管平滑肌细胞的增殖将细胞消化后，制备单细胞悬液。以1×104个/孔接种至96孔板，培养24h后弃去上清，加入条件培养基150μl，每组设8个复孔。培养4d后，吸弃培养液，每孔加入20μlMTT，37℃继续孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μlDMSO终止反应。振荡混匀，置酶标仪上测定490nm处的吸光度(A49

7、0)。　　1.3统计学处理采用SPSS11.5软件，所有数据以x±s表示。组间比较采用方差分析或秩和检验。　　2结果　　2.1血管平滑肌细胞的鉴定倒置显微镜下观察，细胞呈长梭形生长，在细胞生长融合部分可见明显的“峰谷”形态。用平滑肌细胞特异性抗体αSMA进行免疫细胞化学鉴定，光镜下观察可见细胞胞质内棕黄色颗粒，证明培养的细胞为血管平滑肌细胞。见图1。　　图1大鼠平滑肌细胞免疫组化鉴定(DAB，×400)　　2.2CXCL16对平滑肌细胞增殖的影响自CXCL16作用的第1天起，CXCL16组平滑肌细胞增殖能力明显