mitofusin2基因抑制大鼠血管平滑肌细胞a7r5增殖的研究

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1、NingxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sDegreeTheEffectofMitofusin2GeneonSuppressingProliferationofRatVascularSmoothMuscleCellLineA7r5Student’sName:XiShaojingSupervisor:HeJunSubjectCategory：MedicineMajor:InternalMedicineSpecialty:Atherosclero

2、sisSchool：ClinicalInstituteCompletionDate:Apr.2011宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名论文导师签名年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁

3、夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名论文导师签名年月日年月日宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要Mitofusin2基因抑制大鼠血管平滑肌细胞A7r5增殖的研究摘要目的血管平滑肌细胞（vascularsmoothmus

4、clecell，VSMC）异常增殖在血管增生性疾病中扮演着十分重要的角色，是动脉粥样硬化形成、高血压、冠心病、经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄的病理基础。细胞生长因子、炎症因子、血流动力学异常等通过相关的细胞信号转导路径，特别是通过激活Ras原癌基因及其所介导的Ras-Raf-MAPK和Ras-PI3K-Akt信号转导路径，引起VSMC过度增殖。因此,阻扰这些路径,抑制细胞异常增殖，是防治血管增生性疾病的有效途径。线粒体融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)基因是近年来发现的一种新型的增殖抑制基因，它不

5、仅抑制多种肿瘤细胞的增殖，并且参与线粒体的融合、调节线粒体的新陈代谢、维持线粒体的网状结构。在高血压大鼠和球囊损伤后再狭窄大鼠主动脉VSMC中Mfn2的表达均下降，因此上调Mfn2的表达可能会抑制该病理过程。本研究拟应用基因克隆和基因重组等方法，观察外源性Mfn2基因对A7r5细胞增殖的影响，并对其分子机制进行探讨，以期为mfn2成为血管增殖性疾病的治疗靶点提供实验依据。方法通过RT-PCR获得大鼠Mfn2CDS序列的cDNA，扩增、纯化、回收Mfn2基因片段并与载体pGEM-T连接成重组克隆载体pGEM-

6、T-mfn2，转化入E.coliDH5α感受态细胞大量扩增并行氨苄青霉素筛选。用HindⅢ和BamHⅠ双酶切扩增的大鼠Mfn2基因片段和质粒pEGFP-N1，再将回收的pEGFP-N1大片段与Mfn2基因片段重组，转化感受态DH5α。采用质粒小提产物PCR、HindⅢ和BamHⅠ双酶切和序列分析方法，确定目标片段的存在和序列正确性。将测序正确的重组质粒pEGFP-mfn2在阳离子脂质体的介导下体外转染A7r5细胞，将细胞分成三组：空白对照组A7r5（未转染组），空载体对照组（pEGFP-N1组，转染空质粒）

7、，实验组（A7r5-Mfn2-GFP组，转染pEGFP-mfn2）。24h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（greenfluorescenceprotein,I宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要GFP）表达情况，分别于转染后48h收获三组细胞，经RT-PCR、Westernblot方法检测Mfn2在A7r5细胞的表达情况。转染成功且效率稳定后，通过细胞计数法、MTS法检测Mfn2对A7r5增殖的影响。流式细胞术分析外源性Mfn2基因在体外对A7r5细胞周期分布的影响。Westernblot检测三组细胞的

8、磷酸化Raf、磷酸化ERK1/2和磷酸化AKT蛋白表达的变化，采用方差分析对数据进行统计学处理。结果从A7r5细胞总RNA中经RT-PCR扩增出一条约2.2kb的片段。重组质粒转化感受态DH5α后，通过抗性基因筛选出阳性克隆。质粒小提产物PCR显示存在2.2kb的特异性条带；酶切结果显示重组质粒被切成4.7kb大小的pEGFP-N1载体和2.2kb大小的目的片段；经测序，目的片段的序列与GeneBank中大鼠Mf