rocki基因表达下调及其对血管平滑肌细胞迁移的抑制作用

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：答_-7-日期：堕年上月旦日学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，

2、允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。论文作者签名：鱼塑里指导教师签名：凶题签字日期：丝年上月丑日ROCK．I基因表达下调及其对血管平滑肌细胞迁移的抑制作用硕士研究生：白柳孑旨导教师：高颖教授专业名称：生物化学与分子生物学申请学位：硕士学位摘要目的：心脑血管疾病已成为威胁人类生命的重要疾病之一。血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)的增生和迁移，是许多心脑血管疾病发生的重要因素之一

3、。Rho／Rho激酶介导的信号转导通路参与了众多血管生理功能的调节，如细胞骨架重组，平滑肌收缩，细胞增生、黏附、迁移以及其他炎症反应过程，而这些细胞功能又与许多血管疾病的发生发展密切相关。ROCK即Rho激酶，广泛存在于各种组织中，有两种同源异构体ROCK．I，ROCK-II。Rho激酶在多种组织器官的平滑肌收缩中起作用【21。Rho激酶被Rho蛋白激活后，对下游肌球蛋白进行磷酸化，使胞浆中的肌球蛋白轻链磷酸化水平增加，进一步使肌动蛋白和肌球蛋白交联增加，从而使肌动蛋白微丝骨架聚合，引起肌动．肌球蛋白收缩，最终引起VSMC迁移。阐

4、明Rho激酶与血管平滑肌细胞的迁移的分子机制，将为许多心脑血管疾病的研究和治疗提供重要的理论依据【3，4】。本研究拟采用RNA干扰技术，对ROCK．I基因表达进行下调，研究ROCK．I基因与血管平滑肌细胞迁移的关系。为进一步研究Rho激酶与血管平滑肌细胞迁移的分子机制提供实验依据。方法：根据大鼠ROCK．I基因参考序列设计合成siRNA，通过实验筛选出有效的siRNA，然后通过脂质体将ROCK．I的siRNA转入ATr5细胞，对于转染后的细胞进行如下实验：1．提取细胞的总RNA，然后做逆转录PCR，在基因水平上检测ROCK．I基因

5、表达下调的情况；2．提取细胞总蛋白，通过蛋白印迹技术，在蛋白水平上检测ROCK．I基因表达下调情况；3．用Boyden微孔膜双槽法进行细胞迁移实验，测定ROCK．I基因表达下调前后细胞迁移率的影响。结果：’1．siRNA转染效率实验运用带有荧光标记的siRNA分别转染细胞(5h、24h、48h、72h)，在荧光显微镜下观察细胞的转染效率，并进行细胞计数和统计分析。每组时间段做4个平行孔，实验重复3次。结果显示：转染效率分别为77．8％、85．2％、83．3％和85．7％。siRNA5h即可被成功地转染到细胞中，以48或72小时的转

6、染效果最佳。2．脂质体毒性实验用不同浓度的脂质体(分别为0、0．56ng／I．tl、0．83ng／I-tl、1．67ng／Ixl)进行转染，在不同的时间段(24h、48h、72h)收集细胞并进行细胞计数，计算出不同浓度脂质体在不同时间段的细胞死亡率，结合上述siRNA转染效率实验，确定siRNA转染效率最高时脂质体的浓度和最佳的转染时间。最终确定脂质体最佳浓度为0．56ng／I-tl一0．83ng／I_tl。3．在基因水平上的检测：转染48h和72h后，分别提取细胞总RNA，进行RT．PCR反应，在基因水平上检测RNA干扰前后RO

7、CK．I表达量的变化。研究显示siRNA转染后ROCK·I表达量与对照组相比明显下降(P=0．012)。4．在蛋白水平上的检测ROCK．I表达：运用免疫印迹技术，检测转染72h后细胞中ROCK．I表达量的变化。实验结果显示：转染组细胞中ROCK．I蛋白的表达量比对照组明显降低(P=0．022)。5．PDGF—BB诱导血管平滑肌细胞(A7r5)迁移：利用血小板源性生长因子BB二聚体(PDGF．BB)作为诱导剂诱导细胞迁移，用Boyden微孔膜双槽法检测细胞迁移。实验结果显示，PDGF·BB在低浓度时，诱导剂与细胞迁移数量存在剂量依赖

8、关系，随着浓度的增加，细胞迁移的数量增加。当PDGF．BB达到5ng／ml时，随着诱导剂浓度的增加，细胞迁移的数量下降。因此，得出PDGF．BB的最佳诱导浓度为5ng／ml。6．ROCK．I基因表达下调对血管平滑肌细胞(A7r5)迁移的影响：用5n