应用sirna技术下调survivin基因表达以

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1、应用siRNA技术下调survivin基因表达以【摘要】目的利用小干扰RNA(siRNA)技术特异性下调survivin基因的表达，检测SGC7901胃癌细胞转染前后对顺铂敏感性的变化。方法实验分为空白对照组(control组)、单用顺铂组(CDDP组)、脂质体组(Lip组)、单用survivinsiRNA组(siRNA组)、转染survivinsiRNA(转染组)及转染survivinsiRNA联合顺铂作用组(联合作用组)。人工合成survivinsiRNA，通过Lip包裹将siRNA转染胃癌细胞SGC790

2、1，荧光显微镜下观察转染情况。MTT法检测各组细胞的增殖抑制率，ethodsThisexperimentisdividedintothecontrolgroup,cisplatingroup(CDDPgroup),lipsomegroup(lipgroup),siRNAgroup,transfectiongroupandsiRNAbinedCDDPgroup(binedgroup).SurvivinsiRNAe.Thetransfectioneffectsinedbyfluorescencemicroscopy

3、.TheinhibitoryrateofcellproliferationinedbyI1640购自美国GIBCO公司;胎牛血清(FBS)为杭州四季青公司产品;LipfectamineTM2000试剂盒及OPTIMEN转染液为Invitrogen公司产品，兔抗人survivin多克隆抗体购于SantaCruz公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司，顺铂购自江苏豪森药业公司，稀释于RPMI1640培养液中，终浓度为1mg/L。　　1.1.2细胞株人胃癌细胞株SGC7901，由徐州医学院病理学教研室保存。

4、　　1.2方法　　1.2.1实验分组及细胞转染实验分为空白对照组(control组)、单用顺铂组(CDDP组)、Lip组、单用survivinsiRNA组(siRNA组)、转染survivinsiRNA(转染组)及转染survivinsiRNA联合顺铂作用组(联合作用组)，每组设4个复孔。各组作用SGC7901细胞72h后进行相应后续试验。人胃癌细胞SGC7901常规培养至细胞融合约40%～70%时进行转染。用Optimem分别稀释脂质体和survivinsiRNA至试验所需浓度并轻轻混匀，5min后将surv

5、ivinsiRNA稀释液与Lip稀释液混匀，并在室温下放置30min使之充分结合，加入细胞中，轻轻摇晃。37℃5%CO2温箱中培养，4～6h后吸出，加入含10%FBS的RPMI1640培养液。继续培养48h后即可用于后续试验。　　1.2.2MTT法检测细胞增殖抑制率实验分组同前，各组设4个复孔，分别收集转染及未转染细胞，按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，细胞贴壁后，根据分组加入所需试剂及药物。72h后，每孔加入20μl的MTT，继续培养4h，弃上清，加150μl的二甲基亚砜(DMSO)室温振荡10min

6、后570nm波长处测定光密度值(D570)。细胞抑制率(%)=(1-D570处理组/D570对照组)×100%。　　1.2.3免疫细胞化学检测survivin蛋白的表达弃培养基，PBS冲洗2次，固定，再次PBS冲洗。根据SP9001试剂盒说明书进行操作，二氨基联苯胺(DAB)显色。survivin以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。　　1.2.4TT法检测发现CDDP组、转染组及联合作用组对SGC7901细胞的增殖有较明显的抑制作用。其中联合作用组的细胞增殖抑制率最高，与其余各组相比差异有显著性(P<0.0

7、5)。见表1。图1绿色荧光蛋白FITC标记siRNA转染　　SGC7901细胞(×400)　　2.3转染前后细胞中survivin蛋白表达水平的改变　　2.3.1免疫细胞化学检测结果与control组、lip组、siRNA组和CDDP组相比,转染后细胞中survivin蛋白表达明显降低(P<0.05)。见图2、表2。表1SurvivinsiRNA对SGC7901细胞增殖的抑制作用表2各组SGC7901细胞survivin蛋白的表达与其余各组比较：#、*P<0.05;与CDDP组比较：△P<0.

8、05　　2.3.2Westernblot法检测结果转染组survivin蛋白的表达明显低于其余各组(P<0.05);CDDP组作用细胞72h后，survivin蛋白的表达明显高于其余各组(P<0.05)。见表3。　　2.4转染前后对细胞凋亡的影响Honchest33258染色显示control组、Lip组和siRNA组细胞的细胞核完整，呈正常的蓝色;CDDP组、转染组及联合