乳酸乳球菌al2基因文库的构建及乳链菌肽生物合成基因簇的筛选

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1、,%卷#期微生物学报Q6JR,%16R#+%%%年*%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$IM86S:;+%%%""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""乳酸乳球菌./+基因文库的构建及乳链菌肽生物合成基因簇的筛选!陈秀珠胡海菁贾士芳陈美玲还连栋!!（中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京*%%%&%）摘要：用本实验室获得的乳链菌肽高产菌株乳酸乳球菌./+总01.为供体，以!234/!为载体，构建了该菌株的基因文库，共获得!"%%多个噬斑。通过5678

2、9:;<杂交、=)>扩增及01.序列测定，证实从该文库中筛选到一个含有完整乳链菌肽生物合成基因簇的重组噬菌体!?@(!。关键词：乳酸乳球菌，基因文库，乳链菌肽，生物合成基因簇中图分类号：A$&#文献标识码：.文章编号：%%%*-’+%"（+%%%）%#(%,’#(’"乳链菌肽（1BCB<）是由某些乳酸乳球菌（!"#$%#%##&’("#$)’）产生的小肽，对许多革兰氏阳性菌有强烈抑制作用，是一种广泛应用的高效、无毒的天然食品防腐剂。成熟的乳链菌肽分子含有!,个氨基酸残基，分子量约!#*%0D。在生物合成过程中，它首先以前体的形式在核糖体上合成，随

3、后通过翻译后酶修饰作用在特定的位点脱水、形成硫醚桥，产生羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸，并切除前导肽，赋于乳链菌肽分子以杀菌活"(性和热稳定性。由于乳链菌肽的生物学功能及其独特的结构，加之它是一个含!,个氨基酸残基的小肽，因此，对乳链菌肽生物合成有关基因的克隆与表达不仅对研究乳链菌肽的分子结构和功能，而且对进一步研究乳链菌肽的翻译后修饰及建立蛋白质工程研究的模式系统都有重要意义。本工作构建了乳链菌肽高产菌株!*("#$)’./+的基因文库，从中筛选到含有完整乳链菌肽生物合成基因的基因簇。为研究乳链菌肽的生物合成及乳链菌肽的分子结构与功能奠

4、定了基础。!材料和方法!"!菌株与质粒!"#$%#%##&’("#$)’./+、+’#,-.)#,)"#%()@3*%"、E3F#%!由本实验室保存。+*#%()/2!"+购自=;6G:HD公司。E3I54J7:K(L:M86;购自.G:;C9D<公司。!"#工具酶与试剂限制性内切酶、K,01.连接酶、234/!/"0?N.;GC)J6

5、传学系*""+级本科生）作者简介：陈秀珠（*",,-），女，浙江宁波人，副研究员，主要从事乳酸菌分子遗传学研究收稿日期：*"""(%$(%#，修回日期：*"""(**(*%ERR微生物学报EI卷!"#"$%&’"(购自)*+("!,公司。-./-012,3"45#!,#6-"’"7’5+#85’购自9+":*5#!"*;,##:"5(公司。<,=酶购自华美公司。!"#$%&的提取!"#"!乳酸乳球菌总-01的提取按文献［>］。!"#"’质粒-01及!噬菌体-01的提取按文献［?］。!"(!"#$基因的)*+扩增［@］设计如下两条引物：A’端引物（

6、)@）：!"("!引物设计：根据已发表的!"#$-01序列A’B(5#，EAG退火>(5#，H?G延伸>(5#，反应进行@I个循环。!",基因文库的构建用)*+,&-"#12?总-01为供体，!J;92@为载体，%*&’+"2J@F?为转染受体菌。具体操作按)*+("!,公司/"

7、#+(57C4+#5#!;,#K,4进行。!"-噬斑原位杂交、点杂交和./012345杂交按文献［?］和9+":*5#!"*;,##:"5(公司的说明书进行。!"6$%&序列测定)CD扩增产物连接到L;M$94K"IF，依据$,#!"*双脱氧终止法测定-01序列。使用19.公司@H@1自动序列分析仪，测序反应试剂盒购自19.公司，测序全过程按19.公司操作说明书进行。’结果和讨论’"!基因文库的构建以!J;92@为载体，$,K@1>部分酶切本实验室得到的乳链菌肽高产菌株乳酸乳球菌12?总-01［E］，回收

8、>A#?@Q3大小的-01片段，与J;92@双臂连接，用!包装抽提物（L,7Q,!"#"）体外包装，转染%*&’+"2J@F?，构建)*