乳链菌肽(nisin)分子中第29位丝氨酸功能的研究

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1、摘要fJ

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3、IJf『『『f删Ⅷ㈨川删Y17351。1“’‘。94。”。乳链菌肽(nisin)是由部分乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)或乳房链球菌(Streptococcusuberis)菌株产生的一种阳离子多肽，属于A类羊毛硫细菌素。Nisin可有效抑制包括多种食物腐败菌和病原菌在内的革兰氏阳性菌，并对人体安全无毒。因此nisin作为一种天然食品防腐剂广泛应用于多个国家和地区的食品行业中。但llisin在功能上存在不足之处，如只有在低pH值条件下才比较稳定，抑菌谱不广等，这些不足限制了nisin的应用。长期以来，人们对nisin

4、进行了大量的研究，试图通过对nisin结构和功能间的关系的研究，来改善nisin的性质，扩大nisin的应用范围。以前研究的重点主要关注于nisin的环状结构及铰链区，也发现了一些规律。近期本实验室在研究乳链菌肽抗性蛋白(NSR)作用机制的过程中，发现NSR是通过在nisin分子C末端第29位丝氨酸之前切割nisin来发挥抗性作用的，同时对nisin分子氨基酸序列分析显示，第29位丝氨酸还是nisin成熟分子中唯一未经翻译后修饰的丝氨酸，这些发现提示第29位丝氨酸可能对nisin的功能有重要影响。为研究第29位丝氨酸与nisin功能的关系，对nisinZ结

5、构基因第29位丝氨酸密码子进行定点突变，将其突变为其余的19种氨基酸，通过构建重组表达质粒并分别转化至乳酸菌LactococcuslactisNZ9800中，获得了19株表达nisinZ突变体的重组乳酸菌。对表达的nisirtZ突变体的性质进行了检测，结果发现：将第29位丝氨酸突变为天冬氨酸或丙氨酸，所得到的$29DnisinZ和$29AnisinZ的活性较WT明显提高，其余的nisinZ突变体活性均有降低；发现$29AnisinZ抑菌谱较WT发生扩大，对革兰氏阳性菌Staphylococcusepidermdis1．2429出现了抑制作用：而且$29Dn

6、isinZ、$29AnisinZ突变体对温度的稳定性，特别是在高pH值条件下对温度的稳定性较野生型nisinZ有显著提高。上述研究结果证明第29位丝氨酸与nisinZ的活性、稳定性及抑菌谱有密切关系，但关于第29位氨基酸与nisin功能的关系目前仍有很多细节不够清楚，如：同样引入正电荷氨基酸，$29DnisinZ活性较wT增大，而$29EnisinZ较wT降低，这需待进一步的研究。文中创新点：本文通过对nisin中特殊的29位氨基酸进行定点突变，研究了其与nisin功能的关系，证明第29位丝氨酸对nisin功能有重要的作用，同时进一步探索了nisin结构与

7、功能的关系，对帮助更深入地了解nisin结构与功能的关系，优化nisin的性质，获得应用更广泛的nisin提供了可行的依据。关键词：乳酸菌，乳链菌肽，定点突变，结构，功能IIAbstractNisin，producedbysomespeciesofLactococcuslactisorStreptococcusuberis，isakindofcationicpeptideandisclassifiedastype—Alantibiotic．Nisincalleffectivelyinhibitmanygram—positivebacteria，includ

8、ingmanyfoodputrefyingbacteriaandpathogenicbacteria,andnisinissafetohumanbeingforitcanbedegradedbya—chymotrypsin．Nownisiniswidelyusedasnativefoodpreservativeinmanycountriesandareas．Nisinhassomedefects，forexample，onlyatacidconditioncallreachthebeststabilityandsolubility,andnisinshow

9、srelativenarrowantibacterialspectrum，thesedefectslimittheuseofnisin．Foralongtime，scientiststrytoimprovethepropertyandextenttheusageofnisinthroughstudyandunderstandtherelationshipbetweenstructureandfunctionofnisin．Theireffortsmainlyfocusontheringandhingerregionsandrevealsomerules．R

10、ecently,OUrlabdiscoveredthatnisin