乳链菌肽前体基因的扩增、克隆和鉴定

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1、摘要1l乳链菌肽(Nisin)是由某些乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)产生的一种多肷抗菌素，是一种安全无毒的天然生物防腐剂，目前已在乳制品、罐装食品、高蛋白食品及乙醇饮料等食品领域中广泛使用，在食品工业中有着广阔的应用前景，因此，获得乳链菌肽高产菌株是人们梦寐以求的目标。近年来，随着乳链菌肽分子生物学基础研究的不断加深，使得通过基因工程手段来获得乳链菌肽工程菌成为可能。}本研究以乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)ATCC11454的基因组DNA作为获嚷Nisin结构基因的原材料，根据GenBank公布及Buctma

2、an等发表的Nisin结构基因序列，采用PCR技术，设计并合成一对特异引物，从基因组DNA中扩增出DNA片段，并将该片段定向克隆于测序及表达载体PinPointr”Xa-3上。经抗Amp平皿筛选，碱裂解法初筛，PCR、限制性内切酶酶切验证，最后对鉴定为阳性的克隆进行了DNA序列的测定与分析。／主要实验结果如下：＼(1)本文所采用的CTAB／氯化钠裂解液与蛋白酶K共同消化法所提取的DNA有较高的纯度。对本法所得的DNA进行电泳分析发现，点样7L附近具有整齐均～的DNA条带，说明该D咐A具有很好的完整性，没有发生降解。紫外分光光度计分析表明该DNA

3、未受蛋白质及RNA的污染。(2)设计了扩增Nisin前体基因的一对引物，成功地从乳酸乳球菌ATCC11454基因组DNA中扩增出一条约330bp的DNA片段。在上、下游引物的57端分j；

4、：f加HindIII和BamHI两个酶切位点，常规PCR反应组分，采用两步扩增法(前、后两步退火温度分别为420C和66。C)对模板DNA进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示；在约330bp的位置有单一的DNA条带，(3)对PCR产物进行了DNA重组，并对重组子作了筛选与鉴定。重组实验表明，载体分子摩尔数与插入片段摩尔数以1：4的比例混合时具有较高的连接效率。对初

5、筛出的阳性重组子进一步分析鉴定显示，阳性重组子占全部重组子的比例约为12．5％。(4)对阳性重组子的插入片段进行了DNA序列分析。结果表明，插入片段的DNA序列与GenBank公布的该基因序列基本一致，基因序列同源性达98．5％广本研究首次以PinPointl”Xa，3作为克隆乳链菌肽前体基因的载体，该载体可同时进行DNA序列测定和表达分析，克服了以往测序与表达分步进行的缺点。该项工作的完成，为进一步研究乳链菌肽的表达奠定了基础，对最终成功构建乳链菌肽工程菌具有重要意义。关键词：乳链菌肽结构基因PCR克隆Amplification，Clonin

6、gandIdentificationofPro—NisinStructureGeneXieChungang(CollegeofFoodScience，SouthwestAgriculturalUniversity,Chongqing,400716)ABSTRACTGenomicDNAextractedfromLactococcuslactisATCC11454wasuseddirectlyasthetemplateforPCRinthispaper．Theoligonucleotideprimersintroducedintotworestri

7、ctionsiteHindIIIandBamHlweredesignedandsynthesizedaccordingtothenisAsequencereportedbyGenBank．ADNAfragmemwasamplifiedfromLactococcuslactisATCC11454genomebymeansofPCRandclonedintoPinPointmXa-3plasmid．TherecombinantplasmidwastransformedintoE．coliJM109andidentifiedbyampicillinr

8、esistancescreening，alkalinelysisrapidscreening，PCRandrestrictionendonucleasesanalysing．DNAsequencingoftheinsertionalDNAfractionwasperformedatlast．Resultssuggestedasfollowing：(1)ThehighpurityofgenomicDNAextractedbyCTAB／NaCllysisandproteascKdigestionmethodwasobserved．DNAagaros

9、egelelectrophoresisshowedthatthegenomehadahighintegritywithoutdegradation．A