基因工程重组体克隆的筛选和鉴定

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1、第七章重组体克隆的筛选和鉴定一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。第一节载体表型选择法1.原理：pBR322（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：3.选择过程：

2、如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。也可以用含青霉素的培养基直接筛选。青霉素分子不消耗碘，其降解产物青霉酮酸消耗碘，因此可根据碘的显色反应确定氨苄青霉素抗性基因是否失活。蓝色

3、碘没有消耗青霉素没降解阳性克隆抗药性标记选择应注意的问题抗药性标记选择如果用药物直接筛选，观察和确定转化子菌落的培养时间不宜过长，以12－16小时为宜，否则会出现假阳性转化子菌落。因为转化子菌落会降解选择药物，导致非阳性转化子菌落周围选择药物浓度降低。二、-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色1.原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被I

4、PTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。2.选择过程-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。一、原理：第二节根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR的克隆才能生长例：使被转化的受体菌表现出外源基

5、因的表型。2.增加新性状利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。第三节DNA电泳检测法分子量Marker载体重组克隆二、酶切电泳筛选法1.原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片段，再用其它酶切这个片段，电泳后比较结果是否符合预计的结果。ABA或B不同克隆的酶切结果插入片段三、PCR扩增检测法1.原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA

6、片段。2.过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片段引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。1.核酸杂交第四节核酸杂交检测法一、原理：重组克隆与探针杂交。3.识别标记32P或125I。（1）放射性同位素2.检测用的探针与外源DNA插入片段互补的序列。（2）非放射性标记荧光素二、核酸杂交检测方法用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。1.Southernblotting从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有

7、带有插入片段的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。酶切前酶切后插入片段载体含插入片段插入片段探针杂交结果Southernblot筛选结果（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。（2）R-环检测法DNA-RNA杂交。2）原理：3）选择过程在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见R-环形结构。用外源基因的mRNA与重组载体杂交。1）R-环：R-环：是指RNA通过取代与其序列一致的DNA链而与双链DNA杂交，被取代

8、的DNA单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构。缺点：需要电镜！2.Northernblotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片段是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体