基因工程6重组体克隆的筛选与鉴定.ppt

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1、第六章重组体克隆的筛选与鉴定由DNA分子的体外重组，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主，会得到大量的重组体细胞或噬菌体。在这些众多的重组体中，会有多种类型的DNA分子，包括：不带任何外源DNA插入片段，仅由线性载体分子自身连接形成的环状DNA分子；由一个载体分子和一个或数个外源DNA片段构成的重组体DNA分子；单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法，包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性

2、探针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。6.1利用表型特征选择（遗传检测法）表型是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序列提供的，前者应用较多。6.1.1利用载体提供的表型特征选择重组体分子1.抗药性标记插入失活选择法检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效应。例如在pBR322质粒的DNA序列上，编码有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，且在Tetr基因内有BamHI和SalI两种限制酶的单一切点。在这两个识别位点中的任何插入

3、作用，都会导致Tetr基因出现功能性失活，因而根据AmprTets表型即可筛选出在Tetr基因内带有插入DNA片段的重组体细胞。利用环丝氨酸富集法可以简化这种插入失活检测法的程序，该法可以使那些只带有原来质粒载体的细菌致死，从而抑制不含有插入DNA片段的载体分子形成转化子。例如：当外源DNA插入在pBR322质粒的四环素抗性基因(Tetr)上，该基因便会立即失去它的功能作用，而另一种抗菌素抗性基因氨苄青霉素基因(Ampr)，则仍然是完整的。将转化的细菌培养物移至含有氨苄青霉素的培养基中生长，经过这样的选择作用而得以存活下来的所有细胞，都应该带上了pBR322质粒

4、分子。在这些pBR322质粒分子中，有一部分是在其Tetr基因序列内具有DNA插入片段的重组质粒。把这种富集了的培养物作适当的稀释后，转接到含有四环素的培养基中生长，于是在其pBR322质粒分子的Tetr基因序列中带有DNA插入片段的所有细胞，都将停止生长（注意：四环素不会使细胞死亡，只是抑制细胞的生长）。最后加入环丝氨酸，就会促使所有正在生长着的细胞发生溶胞反应，那些没有发生溶胞反应而存活下来的细胞，大约有90~100%都带有pBR322重组质粒，且在其Tetr基因上都含有一个插入的外源DNA片段，这些细胞可通过离心作用收集起来。此外，在pBR322质粒的Am

5、pr基因序列中，也有一个PstI限制酶的唯一识别位点。Ampr基因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指示液（30%I2，1.5%KI，5%青霉素G，0.05M的pH6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜色的改变与否，很容易鉴别出重组体菌落。这种方法的优点是无需把每一个转化子接种在Amp和Tet平板上，直接在转化平板上即可鉴定。其缺点是由于把指示液直接加入选择平板内，极易超成

6、菌落之间的相互污染，给其后的鉴定带来困难。目前使用纸片法使这一方法得到了改善：预先将一定大小的纸片浸泡在指示液中，干燥后密闭保存，使用时只要将纸片覆盖在转化平板上，数分钟内就可以观察到结果。2.-半乳糖苷酶显色反应选择法将pUC质粒转化的细胞，培养在补加有X-gal和乳糖诱导物IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物，使菌落呈现出蓝色反应。当pUC质粒载体的lacZ序列插入了外源DNA片段时，会阻断读码结构，使其编码的肽失去活性，结果产生出白色的菌落。因此，根据这种-半乳糖苷

7、酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA插入序列的重组体克隆。6.1.2利用插入序列提供的表型特征选择重组体分子这种选择法要求所克隆的DNA片段是一个完整的序列，而且能够在大肠杆菌中实现功能的表达。其依据的基本原理是：转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。例如小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）的分离：先将含有DHFR-mRNA的小鼠总mRNA制剂反转录成cDNA拷贝，构建cDNA基因文库。根据小鼠DNFR对于药物三甲氧苄二氨嘧啶呈现抗性这种性状特征，将转化的细菌

8、生长在含有三甲氧苄二氨嘧