重组体的筛选与鉴定1

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1、黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；(3)难插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。第六章重组体克隆的筛选和鉴定转化子和重组子转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子重组子：含有重

2、组DNA分子的转化子成为重组子。如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望克隆子选择(selection)筛选(screening)选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交以及免疫测定，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特异的筛选方法。根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为

3、载体时就不需要筛选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方

4、法。一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。第一节载体表型选择法1.原理：pBR322（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：3.选择过程：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性

5、基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。二、-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色1.原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变

6、的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终止密码；（不破坏肽）。2.选择过程-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。一、原理：第二节根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。DHFR载

7、体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR的克隆才能生长例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状降解利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。第三节DNA电泳检测法分子量Marker载体重组克隆二、酶切电泳筛选法1.原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。酶切前酶切后插入片断载体ABA或B不同

8、克隆的酶切结果筛选过程三、PCR扩增检测法1.原理PCR能在模板序列上扩增出预期