重组子的筛选与鉴定

《重组子的筛选与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第六节重组体的筛选与鉴定转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞DNA的体外重组植物转化体报道基因筛选法（1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（β-D-glucuronidase，GUS）；（2）细菌和萤火虫的荧光素酶（luciferase）；（3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因（GreenFluorescentProtein）。1.报告基因（reportergene)（4）其它几种报道基因的作用原理4-甲-β-D

2、-葡糖醛酸荧光产物GUSGFP紫外光照发绿色荧光5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸蓝色水解产物GUSFirefliesemitlightcatalyzedbyluciferasewithATP转入萤火虫的luciferase的烟草一、遗传检测法报告基因筛选、抗性标志插入失活筛选、半乳糖苷酶蓝白斑筛选、插入基因遗传性状筛选、二、分子检测法PCR扩增检测分子杂交检测三、物理检测法DNA电泳检测限制酶酶切分析法四、免疫化学检测法五、核酸序列分析平板筛选重组子的筛选与鉴定一、遗传学检测法重组体的筛选与鉴定---筛Ampr插入失活筛选:例1在Tet

3、r中插入目的基因在质粒固有的功能基因内插入目的基因，则该基因不能表达有功能的蛋白质。原理：AmpTet1234563和5是阳性克隆123456两种抗生素直接筛选（影印法）无环丝氨酸培养基环丝氨酸辅助筛选（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。（2）氨苄青霉素抗性基因：产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸pBR322抗菌素标记选择原理（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，

4、保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。pUC18/19插入失活筛选:例2在LacZ中插入目的基因载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，可编码β-半乳糖苷酶氨基端即α—肽链，IPTG可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端互补(α-互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal的培养基上生长形成蓝色茵落。将一连串克隆位点克隆入质粒的lacZ基因中，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可使β-半乳糖苷酶的氨基端片段

5、灭活，从而破坏了α-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。这种现象被称为是-互补X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷IPTG:(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)-互补(alpha-complementation)lacZ与蓝白斑筛选-互补(alpha-complementation)通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：无质粒的受体菌-半乳糖苷酶部分

6、缺失，不能分解Xgal；无抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养无菌斑生长质粒转化的受体菌-半乳糖苷酶的缺失被载体产物互补，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有蓝色菌斑生长带外源DNA插入的质粒转化的受体菌载体产物失活，不能互补-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有白色菌斑生长利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。一、原理：2、根据插入基因的遗传表型筛选弥补缺陷his-his+

7、受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。DNA电泳检测法分子量Marker载体重组克隆三、物理检测法根据重组DNA分子大小鉴定重组子原理：有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异。基本方法：提取转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离，电泳迁移慢的带是重组DNA的带。此法是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法，只适用于重组子的初步鉴定。二、酶切电泳筛选法1.原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶

8、切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较