间充质干细胞与汗腺细胞融合实现汗腺再生的研究

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专否则，承担相应法律责任。研究生签名：办3别吲喀师签章河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此

2、进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：刎卅坷导师签章：影弓c忍L训年}月L，Et目录IUllIIIIIIIIIIlY2583455中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5研究论文间充质干细胞与汗腺细胞融合实现汗腺再生的研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10日IJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lU材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35综述细胞融合技术实现汗腺再生的研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45中文摘要间充质干细

4、胞与汗腺细胞融合实现汗腺再生的研究摘要目的：对脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC．MSCs)及人汗腺细胞(humansweatglandcells．h．SGCs)分离培养，找出脐带间充质干细胞的体外合适培养环境，探讨利用细胞融合技术将脐带间充质干细胞和人汗腺细胞在聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)的作用下诱导融合，研究合核细胞的生物学特性，为汗腺再生探索一条新的方法和途径。方法：1UC．MSCs的分离、培养和鉴定：获取无菌足月剖宫产健康胎儿脐

5、带，剔除血管(两条动脉、一条静脉)并用镊子取出脐带中的沃顿胶组织(Wharton’SJelly)剪成大小约lmm3的组织块。将组织块按适当密度接种于培养板中，当镜下观察到组织块周围有呈集落生长的成纤维状细胞时，去除组织块，添加培养液继续培养。当细胞达到一定密度时适时传代，用含0．25％胰蛋白酶和0．02％EDTA的消化液消化，按104／cm2传代培养。流式细胞术检测细胞表面抗原表达情况。2UC．MSCs的标记：将第二代脐带间充质干细胞消化后制单细胞悬液，离心，取细胞沉淀，用稀释液C重悬细胞，迅速加入到PⅪ{26工作液(PⅪ也6染料

6、250倍稀释)中染色1．5min，血清终止反应，DMEM／F12完全培养基洗涤2次后正常培养(具体操作步骤按说明书进行)。在荧光显微镜下观察标记结果。倒置相差显微镜下观察标记后细胞形态。3UC—MSCs生长的影响因素及生长曲线的绘制：用MTT比色法分别检测不同浓度的胎牛血清在490nm处，吸光度值的均数(OD值)。同样用MTT比色法分别检测干细胞不同种植密度在490rim处，吸光度值的均数(OD值、)。观察传代后不同时期干细胞的生长情况并绘制生长曲线。4汗腺细胞(h-SGCs)的培养：取正常全层头部皮肤去除皮下脂肪后，剪成1mm3

7、大小组织块，用II型胶原酶消化法获得汗腺组织，汗腺培养基培养，大部分汗腺团块汗腺细胞(h-SCCs)贴壁爬出后，进行换液，已后3—4天换液一次。对培养的细胞进行免疫组化检测，看CEA和CKl9表面中文摘要抗原的表达情况。5汗腺细胞的标记：将第一代汗腺细胞消化后制单细胞悬液，离心，取细胞沉淀，加入CFDASE细胞标记液和CFDASE储存液(2X)进行标记，完全培养液(含血清)终止标记，洗涤三次后正常培养(具体操作步骤按说明书进行)。在荧光显微镜下观察标记效果。6间充质干细胞／汗腺细胞的融合、筛选及干细胞肝腺细胞融合体的鉴定：融合方法

8、：分别取对数生长期已标记的P3代脐带间充质干细胞和已标记的Po代汗腺细胞，用5mlGENMED清理液(reagentA)清洗，离心，去上清后用GENMED清理液(reagentA)洗涤，取细胞沉淀加入GENMED融合液(reagentB)进行融合，