体外构建组织工程结膜囊移植体治疗重度结膜囊狭窄的实验研究

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1、摘要目的探讨不同创伤方式引起兔结膜囊狭窄的特点，建立稳定的结膜囊狭窄动物模型。应用组织工程技术体外构建“结膜囊移植体”，并探讨其治疗重度结膜囊狭窄的效果。方法1．结膜囊狭窄动物模型的建立30只兔随机分为4组：热烧伤组9只，分别用400。C电焊头逐点烧伤结膜囊3s、6s和10s；碱烧伤组9只，分别用2MNa0H烧伤结膜囊30s、60s和120s；酸烧伤组9只，分别用正庚酸原液烧伤结膜囊60s、120s和180s；眼表上皮切除组3只，切除全部球结膜、穹窿结膜和浅层角膜，以及大部分睑结膜。术后观察结膜囊的变化，4周

2、后测量结膜囊深度，判断结膜囊狭窄程度，组织病理学检查察结膜创面的修复情况。2．应用口腔黏膜上皮细胞体外构建组织工程“结膜囊移植体”选择聚乳酸一羟基乙酸共聚物(PLGA)、透明质酸钠交联共聚物(CLSH)和羊膜(AM)。做为黏膜上皮细胞体外培养的载体材料。取兔颊部口腔黏膜上皮细胞，体外扩增得到足够数量的种子细胞。将细胞分别接种到三种载体，检测细胞在不同载体上的粘附和增殖能力。选择6只兔，每只兔双眼鼻上和颞上球结膜下分别做一直径10mm囊袋，其中三个分别植入三种载体材料，另一个做为空白对照，观察局部炎症反应和材料

3、的吸收情况，术后2周和4周分别取材行组织病理学检查，观察材料吸收情况以及局部炎症反应和纤维组织增生情况。选择一组织相容性好的载体接种口腔黏膜上皮细胞，然后包覆于塑料薄壳义眼片表面，体外培养7～10天，组织病理学和免疫组织化学检测材料上细胞生长情况。3．结膜囊移植体治疗结膜囊狭窄的初步研究将6只重度结膜囊狭窄兔随机分成三组，均接受结膜囊成形手术治疗。A组植入13腔黏膜上皮细胞体外构建的结膜囊移植体，B组植入以AM和薄壳义眼片构建的复合载体，C组植入单纯薄壳义眼片。术后两周取出薄壳义眼片，测量结膜囊深度；一月后再

4、次测量结膜囊深度，计算结膜囊的收缩比例，组织病理学和免疫组织化学检测结膜囊上皮的修复情况以及细胞的表型变化。结果(一)热烧伤组术后球结膜和穹隆结膜环形收缩形成双结膜囊结构，烧伤10s者出现眼睑缺血坏死，术后4周3例烧伤10s者达重度结膜囊狭窄，但均有明显日艮睑缺损和睑缘粘连；组织病理学检查显示外结膜囊内结膜上皮排列紊乱，上皮下胶原纤维增生明显，而内侧结膜囊内大部分结膜上皮形态规整。酸烧伤组术后24小时结膜缺血完全恢复，术后4周结膜囊狭窄程度均为轻度；组织病理学检查显示结膜上皮细胞形态良好，结膜下仅见少许胶原纤

5、维增生。碱烧伤组术后早期结膜缺血坏死，72h后部分血运逐渐恢复，术后周两例180s烧伤者出现角膜穿孔，术后4周仅1例出现重度结膜囊狭窄；组织病理学检查示残存结膜上皮细胞排列紊乱，结膜下胶原纤维增生明显。眼表上皮切除组术后结膜囊逐渐缩窄、广泛睑球粘连，角膜创面被假性胬肉覆盖，术后4周所有结膜囊狭窄程度均达重度；组织病理学检查示结膜创面大量胶原纤维增生。(二)兔口腔黏膜上皮细胞在六孔板内扩增一代，可得到1～2×106个／孔。细胞在不同材料上的粘附能力分别为CLSH>AM>PLGA，细胞在材料上的增殖能力分别为AM

6、>PLGA>CLSH。载体结膜下植入后，空白对照和AM植入部位1周内局部充血完全消退，术后2周结膜下AM结构已分辨不清；PLGA和CLSH植入部位结膜充血逐渐减轻，至术后4周局部结膜血管仍明显扩张，结膜下形成暗红色结节样肿物，以PLGA较为明显。组织病理学检查显示AM植入部位术后2周仅见少量炎性细胞浸润，术后4周完全消失；CLSH植入部位大量多核巨细胞浸润，周围新生血管和纤维组织增生；PLGA植入部位大量嗜酸性粒细胞浸润，周围纤维组织增生明显，形成囊样结构：口腔黏膜上皮细胞接种到AM后5天，可见克隆形成，包覆

7、义眼片后细胞克隆继续增殖并形成细胞单层，组织病理学和免疫组织化学检查显示“结膜囊移植体”表面均有黏膜上皮细胞单层形成，CK3和P63染色阳性。(三)6只兔均成功接受结膜囊成形手术。术后2周取出义眼片后A组结膜囊深度为1O～】4mm，B组9．5～13．5mm，C组8．5～14．5mm；术后6周A组兔结膜囊深度为6．5～1lmm，B组为5～9mm，C组为3．5～7．5mm。组织病理学检查显示三组兔重建的结膜囊均见单层黏膜上皮细胞覆盖，部分区域可见接近『F常结膜上皮结构；免疫组织化学检查显示A组深部结膜囊少量上皮细

8、胞CK3和CK4表达阳性；B和C组CK4表达阳性，未见CK3表达。结论眼表切除法可以建立稳定的重度结膜囊狭窄动物模型。以AM为载体可以在体外构建具有单层黏膜上皮细胞的结膜囊移植体，能够简化结膜囊成形手术操作，在一定程度上有效缓解结膜囊狭窄。关键词：结膜囊狭窄；动物模型；口腔黏膜；组织工程AbstractPurposeTostudythefeaturesofrabbitconjunctivalsacs